오픈 소스 smfBox를 사용하여 정확하고 정확한 단일 분자 FRET 측정

Summary

이 문서에서는 스위치 켜기부터 정렬 및 초점, 데이터 수집 및 분석에 이르기까지 오픈 소스, 저렴한 smfBox를 사용하여 생체 분자를 자유롭게 확산시키는 개별에 대해 완전히 수정된 정확한 FRET 측정을 만들기 위한 단계별 지침을 제공합니다.

Abstract

smfBox는 단일 분자 Förster 공명 에너지 전송 (smFRET)을위한 최근 개발 된 비용 효율적인 오픈 소스 기기로, 자유롭게 확산 생체 분자에 대한 측정을 보다 쉽게 사용할 수 있습니다. 이 개요에는 샘플 준비, 계측기 설정 및 정렬, 데이터 수집 및 완전한 분석 루틴의 세부 사항을 포함하여 이중 DNA 샘플에서 정확한 FRET 효율성을 측정하기 위해 이 계측기를 사용하기 위한 단계별 프로토콜이 포함되어 있습니다. 정확한 FRET 파생 거리 측정에 필요한 모든 보정 요소를 결정하는 방법을 포함하는 제시된 접근 방식은 표준 프로토콜 및 분석 접근 방식을 설정하는 것을 목표로 하는 FRET 커뮤니티 전반에 걸쳐 최근 협력 작업의 큰 본체를 기반으로 합니다. 다양한 생체 분자 시스템에 쉽게 적응할 수 있는 이 프로토콜은 광범위한 과학 커뮤니티를 위한 smFRET 민주화에 대한 노력이 증가하고 있습니다.

Introduction

단일 분자 Förster 공명 에너지 전송 (smFRET)는 개별 분자의 수준에서 두 염료 -a 기증자와 수용자 사이의 FRET 효율을 측정하는 기술이다. FRET는 두 염료의 중복 에너지 스펙트럼에서 발생하는 광물리 학적 과정입니다 : 기증자는 특정 파장의 빛에 흥분하고 수용자에서 방출의 결과로, 수용자로 비 방사 적으로 에너지를 전송합니다. 이 전송의 효율은 두 염료 사이의 거리의 여섯 번째 힘에 반비례하므로 전송 효율은 ^distance1에 따라 다릅니다. 따라서, 이러한 FRET 효율은 염료가 부착되는 분자에 대한 공간 정보를 결정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 규모와 FRET 효율의 변화가 Angstrom 분자 운동에 민감하다는 ^{사실은, 핵}산 및 단백질과 같은 생체 분자에 대한 구조적 정보를 평균 ^4,5,6의 합병증없이 조사하는 데 적합한 기술을 만든다. 상대적인 FRET 효율성의 변화는 생체 분자 상호 작용 및 형성 역학을 모니터링하는 데 사용될 수 있지만, 단백질(un)접기, 전사 및 DNA 복제 및 수리와 같은 주요 세포 공정에 빛을 흘리는 반면, 절대 FRET 효율은 생체 분자 구조 결정에 대한 정확한 거리를 결정하는 데 사용되어 왔습니다7,8,9,10,111 , 다른 구조적 방법에 필요한 결정화 또는 동결의 필요성을 극복^4,12.

smFRET 실험은 가장 일반적으로 두 가지 형태를 취, 공초점 또는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 검사. 두 접근 사이 생체 분자의 분자 역학은 전형적으로 pico-to millisecond (공초점, 자유롭게 확산 분자)에서 시간까지 시간 척도에서 조사 할 수 있습니다 (TIRF, 표면 고정 분자). 이는 각 기술에 관련된 다양한 설정 때문입니다. TIRF 현미경 검사법에서 분자는 슬라이드 표면에 고정되어 에반센드 파에 흥분됩니다(그림 1A). 여기서, 그러나, 초점은 이 smfBox의 형식이기 때문에 공초점 현미경 검사법에 있습니다. 공초점 현미경 검사에서 분자는 고숫자 조리개 렌즈를 통해 레이저 빔을 솔루션 내의 일부 지정된 깊이에서 스팟으로 집중하여 형성된 공초점 부피(~1fL)를 통해 브라우니아 운동을 통해 자유롭게 확산된다(그림 1B). 생성된 방출은 동일한 조리개를 통해 다시 초점을 맞추고 이색 거울을 통해 필터링됩니다(전체 회로도의 그림 1C ). 그런 다음 초점이 맞지 않는 빛을 제거하고 눈사태 포토다이오드(APD)에 초점을 맞춥니다. APD가 광자를 감지하면 TTL 펄스를 출력하며, 타이밍은 최대 피코초 해상도로 기록될 수 있습니다. 공초점 부피 부근내에서 자유롭게 확산되는 분자의 관찰 시간은 일반적으로 밀리초 의 순서 내에 있습니다.

그림 1: 현미경 검사법과 smfBox 설정의 원리를 보여주는 회로도. (A) 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 원리 : 흥분 빛은 목표 (Obj.)의 가장자리로 지시하고 기하급수적으로 부패 하는 에반스 엔스 필드를 생성하는 커버 슬립 버퍼 인터페이스에서 총 내부 반사를 겪는다. (B) 공초점 현미경 검사: 분자를 자유롭게 확산시키는 것은 시료에 초점을 맞춘 거의 회절 제한 지점에 의해 흥분됩니다. (C) 눈사태 포토다이오드(APD), 빔 스플리터(BS), 이색 거울(DM), 필터(F), 미러(M), 목표(O) 및 핀홀(P)의 모든 주요 구성 요소를 보여주는 이 프로토콜에 사용되는 smfBox 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

최근에는 smFRET 기술이 두 가지 색 여기를 통합하여 기증자와 수용자 내분 파장을 일치시키는 레이저가 번갈^{아 5입니다}. 이것은 두 가지 방법 중 하나에서 수행 할 수 있습니다, KHz 기간에 연속 파 레이저를 변조하여 첫 번째, 이는 교대 레이저 여기로 알려진 (ALEX)^13,14. 두 번째 방법은 MHz 시간 척도에서 빠른 펄스를 인터링합니다. 이는 나노초-^ALEX15 또는 펄스 인터리브 된 여기 (PIE)¹⁶입니다. 이러한 모든 접근법에서, 수용자 레이저의 정보는 소위 stoichiometry의 계산으로 이끌어 냅니다, 이는 낮은 FRET 효율을 가진 분자와 수용자가 부족한 사람들 (불완전한 라벨링 또는 광표백을 통해)를 구별할 수 있는. PIE/ns-ALEX를 사용하면 단일 분자 수준에서 형광 수명에 추가로 접근할 수 있으며, 편광 광학과 결합될 때 이산화정도를 측정할 수 있습니다. 이러한 측정 조합은 다중 파라미터 형광 검출(MFD)⁹라고 합니다.

smFRET의 많은 장점에도 불구 하 고, 그것은 널리 상업 악기의 높은 비용과 간단한의 부족으로 전문 실험실 외부에서 사용 되지 않습니다., 자체 빌드 대안. 저가형 오픈소스 현미경 검사법의 개발을 향한 추세가 증가하고 있으며 플랑크톤코프¹⁷, 오픈플렉스어마이크로스코프¹⁸, 플렉시코프¹⁹, miCube20, liteTIRF21 및 Squid22를 포함한 다른 플랫폼이 최근 등장했습니다. 본 연구에서는 단일 분자를 자유롭게 확산시키는 데 대한 두 염료 사이의 FRET 효율을 측정할 수 있는 최근 개발된 비용 효율적인 공초점 설정인 smfBox를 사용하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 자세한 빌드 지침과 필요한 모든 운영 소프트웨어는 https://craggslab.github.io/smfBox/ ²³에서 자유롭게 사용할 수 있습니다. smfBox의 광학 배열은 저렴하고 널리 접근 가능한 제조업체에서 구입한 쉽게 사용할 수 있는 구성 요소에서 조립되며, 현미경 본체(표준 공초점 설정에서 비용의 대부분을 담당함)는 사용자 정의 조명 이밀한 양극산화 알루미늄 상자로 대체되었습니다(주변 조명 조건에서 측정할 수 있음). 이 상자에는 여기 이색, 목표 및 핀홀, 기계식 레이저 인터록을 포함한 주요 광학 부품이 포함되어 있어 Class I 레이저 제품으로 안전한 작동을 가능하게 합니다(전체 회로도의 그림 1C 참조). smfBox는 ALEX를 사용하여 염료 스토이치오메트리의 유효성을 검사하고 정확한 FRET 보정 요인을 결정합니다. 데이터 수집의 모든 측면을 제어하고 많은 타사 분석 도구와 호환되는 오픈 소스 광자-HDF5 ^format24의 데이터를 출력하는 맞춤형 오픈 소스 소프트웨어(smOTTER)를 사용하여 작동됩니다. smfBox 및 수집 및 데이터 분석 프로토콜은 최근 멀티 랩 블라인드 연구에서 >20 개의 다른 기기 (공초점 및 TIRF 모두)에 대해 테스트되었습니다²⁵. 얻은 FRET 효율성은 smfBox가 시판되는 설정 가격의 일부만 비용에도 불구하고 다른 모든 악기와 우수한 계약을 맺었습니다.

여기서 단계별 프로토콜은 smfBox를 사용하여 DNA 듀플렉스를 자유롭게 확산시키는 데 있어 정확하고 절대적인 FRET 효율성을 획득하고 분석하기 위해 설명되어 있으며, 전원켜기부터 정렬 및 초점, 데이터 수집 및 분석에 이르기까지 모든 방법을 제공합니다. 여기서 사용되는 샘플은 세계 적인 맹목적^{인 연구에서 평가}된 3개의 이중 DN(고, 중간 및 저FRET 효율성을 전시하고, 표 1참조)입니다; 그러나, 이 방법은 단백질 및 기타 핵산을 포함한 많은 분자 시스템에 적응할 수 있다. 희망은 이러한 상세한 프로토콜, smfBox23에 대한 기존의 기존 빌드 지침과 함께, 실험실의 넓은 범위에 더 액세스 할 수있는이 강력한 기술을 만드는 데 도움이 될 것입니다.

Protocol

1. 전원 구성 요소 6개의 플러그의 전원(특정 순서 없음): 압조컨셉(z-focus), APD0, APD1, 그린 레이저, 레드 레이저 및 광검출기. 2. 소프트웨어 1 실험 설정 레이저 제어 센터를 시작합니다. 연속 파- 일정한 전류(CW-ACC) 모드를 교대로 선택합니다. 두 레이저에 전원을 공급합니다. 레이저 전원을 확인/설정합니다.참고: 레이저 출력은 흥분 경로의 ND 필터및 빔 스플리터가 레이저 제어판에 주어진 수로부터 레이저 전력을 감소시키기 때문에 흥분 이분해성 바로 전에 측정된 대로 조정되어야 합니다. 여기에 주어진 숫자는 여기 dichroic에서 전원, 하지만이에 해당 하는 레이저 제어에 전원 밖으로 작동 해야 합니다. 220 μW 녹색 레이저 (515 nm, 40 mW) 적색 레이저용 μ70 W (638 nm, 10mW) smOTTER 인수 소프트웨어 레이저, 검출기, z 단계 및 카메라를 연결합니다. 올바르게 구성합니다(특정 NI 카드 설정의 설정에 따라 달라질 수 있음). 3. 배출 경로의 정렬 (일상적으로 필요하지 않음) 정렬 설정 파이펫 10 μL 무료 Cy3B 염료 (~100 nM)는 현미경 및 아래 단계 4.3-4.5에 설명된 바와 같이 초점에.참고: 수락자 채널에 누출이 있는 또 다른 기증자 염료도 작동합니다. smOTTER에서 정렬 탭을 열고 레이저 전력을 낮추고 검출기에서 판독이 보일 때까지 y축 축 을 변경합니다.참고: 여기서 목표는 신호를 늘리는 것이므로 신호가 증가한 후 스케일을 다시 변경해야 할 수 있습니다. smfBox 전면에 있는 네 개의 나사를 풀고 전면 패널을 제거합니다. 핀홀 정렬 정렬 탭의 신호를 보면서 핀홀 포지셔서의 x 노브를 켜고 녹색과 빨간색으로 신호를 증가시게 합니다. 이제 y 노브를 돌려 핀홀을 다른 방향으로 정렬합니다. x 노브로 돌아가 신호가 더 이상 증가하는지 확인합니다. 핀홀 렌즈 정렬 렌즈 x 노브를 한 방향으로 돌리면 신호가 줄어듭니다. 핀홀 x 노브를 같은 방향으로 돌려 신호를 다시 늘립니다. 새 최대 신호가 이전보다 높으면 핀홀과 렌즈를 모두 반복적으로 이동합니다. 이전보다 낮은 경우 반대 방향으로 반복적으로 이동합니다. y를 위해 위에서 반복하십시오. APD 렌즈 정렬 녹색 APD부터 녹색 신호가 최대일 때까지 x 노브를 이동합니다. y 손잡이를 반복합니다. x 노브로 돌아가서 앞뒤로 이동하여 신호가 떨어지기 시작하는 임계값 점을 찾아 이 두 점 사이의 중간 위치에 둡니다. x 노브를 반복합니다. 빨간색 APD 렌즈에 대한 위의 단계를 반복하여 빨간색 신호를 보세요. 전면 패널을 smfBox에 다시 놓고 나사를 교체합니다.참고: 상기 정렬 월yl을 수행하고, 현미경이 측정 사이에 정렬 결함을 개발했다고 의심되는 경우 예방 조치로 수행합니다. 4. 측정 데이터 수집 첫 번째 샘플의 경우, 메탄올에 담근 렌즈 청소 조직으로 무대를 청소하십시오. 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝까지 목표를 부드럽게 닦으십시오. 목표의 중심에 현미경 검사법을 위해 3-4 방울의 침지 오일을 적용하십시오. 샘플 간에 필요에 따라 보충합니다. 샘플 준비 파이펫 10 μL 의 샘플 (첫 번째 사용 유형 I 초순수 물) 깨끗한 커버 유리의 중앙에. 커버 글래스를 유리와 목표 사이에 포획하지 않도록 오일에 비스듬히 낮추는 객관적인 렌즈에 조심스럽게 놓습니다.참고: 필요한 경우 덮개 유리를 밀어 오일의 기포를 초점에서 멀리 밀어 넣습니다. 교대-레이저 여기를 수행 하기 위해 (ALEX) 실험 레이저 듀티 사이클 패널에서 레이저를 구성 다음과 같이. 기증자 (녹색 레이저) 0 꺼져, 45 켜기, 55 끄기 수락기 (빨간 레이저) 50 끄기, 45 켜기, 5 끄기 알렉스 기간(μs): 100 리본의 Z 포커스 탭을 클릭합니다. 획득 패널에서 레이저를 라이브 로 전환하고 카메라를 시작합니다. 밝은 반점이 중앙에 검은 색으로 둘러싸여 표시되도록 노출을 조정합니다.참고: 카메라는 커버슬립과 샘플 사이의 유리/물 인터페이스에 의해 반사되는 빛을 포착하고 초점이 이 인터페이스에 있을 때 가시광선의 가시원은 가장 작은 직경에 있습니다. 따라서 이 인터페이스 아래에서 시작하여 z 높이를 인터페이스로 늘린 다음 약간 더 더 초점을 맞추어 커버슬립 위와 측정중인 샘플에 집중해야 합니다. 낮은 Z 위치에서 시작하여 밝은 반점이 최소한의 크기에 도달할 때까지 높이를 늘린 다음 높이를 최대 20μm까지 높여 레이저를 오일 과 커버 유리 위에 초점을 맞춥니다. 카메라를 한 번 초점으로 중지합니다. 설치가 적절하게 수행되었는지 확인하기 위해, 형광 신호가 없는 것을 확인하기 위해 타입 I 초순수물의 흔적을 모니터링한다. 샘플이 준비되는 버퍼에 대한 순도 확인을 반복합니다. 고무 끝 핀셋으로 커버 글래스를 조심스럽게 제거하여 객관적인 피해를 피한 다음 위와 같이 준비된 관심 샘플을 목표에 배치합니다. 커버 유리와 목표 사이의 균일한 접촉 영역을 유지하기 위해 필요에 따라 침수 오일을 보충하십시오(커버 유리및 객관적초점 영역에 대한 샘플의 접촉 영역에 특별한 주의를 기울인다). 농도 빙고 단일 분자 데이터를 얻기 위해 샘플은 smOTTER의 라이브 추적 패널에서 초당 1-5 버스트가 관찰되는 농도에 있어야 합니다(이것은 하나 이상의 분자가 한 번에 검출 부피에 존재할 가능성을 최소화합니다). 적절한 농도가 결정되었을 때 측정을 수행하십시오. 긴 실험 중에 증발을 방지하기 위해 밀폐 된 샘플 챔버를 준비하십시오. 실리콘 이졸거(직경 8-9mm 구멍)를 커버 글래스 의 중앙에 아래로 누릅니다(파이펫 팁으로 착색). 그런 다음 샘플을 조심스럽게 중심으로 피펫하여 실리콘과의 접촉을 피합니다. 그런 다음 두 번째 커버 글래스를 위에 놓고 눌러 씰을 형성합니다. 라이브 스토이치오메트리 vs FRET 효율(ES) 히스토그램을 확인하여 샘플이 예상대로 행동하고 있는지, 즉 예상 FRET 효율과 합리적인 스토이치오메트리(~0.5)를 확인합니다. 샘플이 준비되면 실험에 대한 세부 정보를 저장 설정 패널에 입력합니다. 저장 설정 패널에서 타원 아이콘(hdf5/h5 형식으로 저장된 파일)을 클릭하여 적절한 디렉터리 및 파일 이름을 선택합니다. 샘플 이름, 샘플 세부 정보, 기증자 및 수락자 라벨, 버퍼, 기증자 및 수락자 흥분 파장, 검출 파장 및 레이저 전력, 사용자 및 사용자 소속에 대한 정보를 입력합니다. 리본의 라이브 추적 탭으로 돌아가고 수집 패널에서 실험 길이(분)를 입력하고, 적절한 저장 간격을 선택하여 오류가 발생할 경우 잠재적인 데이터 손실을 완화합니다. 필요한 경우 레이저 파워 저장을 선택합니다. 데이터를 가져 오려면 시작 하십시오.참고: 정확한 FRET 측정을 가능하게 하려면 동일한 기증자 및 수용자 염료를 포함하지만 충분히 다른 FRET 효율성을 포함하는 최소 2개의 샘플을 측정해야 합니다. 5. 분석 /소프트웨어 2 FRETBursts 파이썬 패키지와 함께 Jupyter 노트북을 시작합니다 (설정 지침은 여기에서 찾을 수 있습니다 : https://craggslab.github.io/smfBox/anasoftware.html) 절대 FRET 효율성에 대한 보정이 필요하지 않은 경우(즉, FRET의 상대적 변화만 측정에 충분합니다) Jupyter 노트북 FRET Analysis 1.4 수정되지 않은.ipynb를 시작합니다. 이 것을 사용하여 다른 소프트웨어에서 추가 분석 또는 플로팅을 위해 수치 또는 데이터를 csv 파일로 내보냅니다.참고: 각 노트북에는 분석 절차를 안내하는 자세한 지침이 포함되어 있습니다. 버스트 검색 알고리즘, 배경 보정 및 모든 보정 매개 변수를 포함하여 분석 절차에 대한 보다 자세한 내용은 23,25를 참조하십시오. 절대 FRET 효율성에 대한 보정이 필요한 경우, 크로스토크 매개변수 알파(기증자 방출의 유출)와 델타(기증자 의 발아액비율)를 계산하여 시작한다. 먼저 Jupyter 노트북 보정 팩터 파인더 알파-Delta.ipynb 를 실행하고 알파 및 델타 매개 변수를 결정합니다.참고: 샘플 간에 일관성이 없는 경우 현미경은 측정 또는 염료의 스펙트럼 사이에 정렬 문제가 샘플 간에 다를 수 있습니다. 알파 및 델타 매개 변수가 일관된 경우 Jupyter 노트북 보정 팩터 파인더 Gamma-Beta.ipynb 를 시작하여 감마 및 베타 매개 변수(염료 간의 흥분 및 검출 효율성의 차이를 고려)를 결정합니다.참고: 감마와 베타 플롯이 잘 맞지 않으면 현미경이 측정 또는 양자 수율 사이에 정렬 문제를 일으켰거나 염료의 소멸 계수는 샘플마다 다를 수 있습니다. 4개의 크로스토크 파라미터가 결정되면, 이러한 요소는 FRET 분석 1.4 보정.ipynb Jupyter 노트북에서 절대 FRET 효율성을 결정하는 데 사용될 수 있다. 6. 문제 해결 모든 신호가 낮거나 버스트당 카운트가 예상보다 낮은 경우(이는 염료 의존성이지만 SMFBox의 경우 ATTO-550 및 ATTO-647N의 경우 단일 분자 버스트 동안 MS당 50~100개 수)를 재정렬합니다. ES 히스토그램에 이중과 노래로 표시된 인구 사이의 다리.참고: 이것은 너무 높은 농도에서 작업하 여 발생할 수 있습니다 (샘플을 희석 하 여이 해결), 또는 광 표백에 의해, 너무 높은 레이저 전력을 사용 하 여 발생할 수 있는 (레이저 전력을 감소 하 여이 해결). 버스트 비율이 실험 전반에 걸쳐 떨어지는 경우 (형광 표지 된 분자는 유리 커버 슬립을 준수 할 가능성이 있습니다), 정류BSA의 증가 농도를 사용합니다. 실험 전반에 걸쳐 버스트 속도가 증가하면(샘플이 증발할 가능성이 있음), 위에서 설명한 바와 같이 공기가 단단한 샘플 챔버를 준비한다. 정렬 중에 신호가 0으로 충돌하는 경우(소프트웨어가 검출기의 신호에 의해 압도될 수 있음), 레이저 전력을 낮추거나 보다 희석된 정렬 샘플을 사용합니다. Z 포커스가 동심 링을 표시하는 경우(여러 개의 커버립이 목표에 배치된 경우 발생할 수 있음) 목표에 대해 여러 커버립을 확인합니다. 시료에 중간 스토이치오메트리(집계된 분자에 의한)의 밝고 긴 파열이 포함되어 있는 경우 세제를 사용하거나 시료 정화 프로토콜을 수정합니다.참고: 일부 버퍼 구성 요소에는 시간 추적에서 단일 색상 버스트로 표시하기에 충분한 소량의 적당히 형광 오염 물질이 포함되어 있기 때문에 깨끗한 버퍼를 얻는 것은 문제가 될 수 있습니다. 버퍼에 너무 많은 것이 있는 경우 샘플 버스트와 일치하여 측정되는 FRET 효율 또는 stoichiometry를 변경할 수 있습니다. 특히 BSA는 종종이 점에서 문제가 될 수 있습니다, 그래서 오염 물질을 광표백하기 위해 강력한 광원에 주식 BSA 솔루션을 노출하는 것이 도움이됩니다.

Representative Results

이 프로토콜은 설정 중에 실험 조건에 대한 중요한 평가가 필요합니다(프로토콜 단계 4.8 참조). 실험의 성공 또는 실패를 결정하는 획득한 첫 번째 결과는 이 단계에서 달성됩니다. 긍정적인 결과는 초당 5~1회 버스트를 갖는 것입니다( 그림 2B, C 참조). 부정적인 결과는 해당 시간 내에 너무 많은(그림 2A) 또는 너무 적은 버스트(그림 2D)가 있을 것입니다. 이러한 오류를 바로잡기 위해 이 단계에서 는 여전히 가능합니다: 농도가 너무 높은 샘플은 단순히 희석될 필요가 있습니다. 그러나 농도가 너무 낮으면 새로운 샘플을 준비해야 할 수 있습니다(결정자는 합리적인 시간 프레임에서 데이터를 수집하기 위해 이 낮은 농도에서 가능한지 여부). 그림 2: 이중 표지된 이중 DNA 샘플의 다른 농도를 보여주는 실험 설정 중 라이브 추적에서 의 스크린 샷. (A) 너무 높고, (B) 상한 허용 한계, (C) 표적 농도, (D) 너무 낮다. 광자 개수(1ms bins)는 3개의 검출 채널에 표시됩니다. 기증자 여기 후 기증자 배출 (DD), 기증자 여기 후 수용자 배출 (DA), 수락 자 여기 후 허용 자 방출 (AA). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 정적 단일 종 시스템은 일반적으로 강력한 데이터 분석에 필요한 ~1,000개의 버스트를 얻기 위해 30~60분의 측정이 필요합니다. 여러 종 또는 동적 시스템으로 필요한 시간 및 버스트 수가 증가합니다. 프로토콜 수치를 사용하여 데이터 수집 및 분석을 다음 Jupyter 노트북에서 내보냅니다. 교대 플롯(그림 3A)은 실험 설정의 ALEX 기간과 일치해야 합니다. 시간 추적(그림 3B)은 샘플 농도가 합리적이라는 것을 질적으로 평가하는 데 사용됩니다. 배경 플롯(그림 3C)은 배경 비율을 추정하기 위해 더 긴 시간에 선형 으로 맞을 수 있는 광자 간 지연 기간의 분포를 보여 주어집니다26. 배경 추적(그림 3D)은 실험 기간 동안 샘플에 변화가 있었는지 확인할 수 있습니다. 주로 이것은 더 긴 인수 시간 동안 증발 때문일 것입니다. ES 히스토그램은 모든 광자(그림 3E) 및 이중 라벨이 부착된 종(그림 3F)에 대해 생성됩니다. 마지막으로, 버스트 데이터의 가우시안 피팅으로 1D E 히스토그램(도 3G)이 생성됩니다. 그림 3: Jupyter 노트북에 의해 생성된 분석된 데이터의 예 수치 출력. (A) 교대 플롯, (B) 시간 추적, (C) 배경 결정, (D) 배경 속도, (E) 모든 광자 ES 히스토그램, (F) 듀얼 채널 ES 히스토그램 및 (G) 1D E 히스토그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 이름 순서 1a 5′-개그 CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT 개그 TTGT TTG TCT GG – 3′ 3′- CTC GAC TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC – 5′ 1b 5′-개그 CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT 개그 TTGT TTG TCT GG – 3′ 3′- CTC GAC TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC – 5′ 1c 5′-개그 CTG AAA GTG TCG AGT TTG TTT 개그 TTGT TTG TCT GG – 3′ 3′- CTC GAC TTT CAC AGC TCA AAC AAA CTC ACA AAC AGA CC – 5′ 표 1: 프로토콜에 사용되는 DNA 서열. 뉴클레오티드는 각각 Atto-550 및 Atto-647N으로 표시된 C2 아미노 변형 티민 잔류물을 나타내는 파란색과 빨간색으로 강조된다. 수정 요소 파인더 알파 델타 : 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 수정 요소 파인더 감마 베타 : 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. FRET 분석 1.4 수정: 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. FRET 분석 1.4 수정되지 않은: 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

프로토콜에서 가장 중요한 단계는 현미경의 정렬및 정확한 희석에 샘플 농도를 조정하는 것입니다. 정렬이 꺼진 경우 버스트를 식별하고 히스토그램을 플롯하는 신호가 충분하지 않을 수 있으며 샘플 간에 정렬이 잘못 발생하면 누설 및 감지/흥분 효율성의 변화로 인해 정확한 FRET 보정이 실패할 수 있습니다. 적절한 농도의 사용은 또한 중요 하다, 너무 높은 농도 일치 된 버스트를 줄 것 이다, 잠재적으로 다른 FRET 효율성 또는 라벨 stoichiometries와 여러 분자를 포함. 농도가 너무 낮을 때 강력한 데이터 분석을 위해 너무 적은 버스트를 줄 수 있습니다.

여기에 설명된 프로토콜은 정적 단일 FRET 종에서 거리를 측정하기 위한 것입니다. 샘플이 FRET 효율 히스토그램에 두 개 이상의 피크를 가지고 있거나 피크가 광범위하게 나타나면 (동적 종으로 발생할 수 있음), 히스토그램을 동일한 정도의 정밀도에 맞추기 위해 더 많은 버스트가 필요할 수 있습니다. 잘 분리된 두 개의 피크의 경우 약 두 배의 데이터가 필요하지만 인구가 약간 겹치면 더 많은 데이터가 필요합니다.

두 집단이 실험의 시간 척도에서 상호 변환하는 경우 시스템의 역학 및 운동을 잠재적으로 결정할 수 있습니다. ^BVA27 및 ^2CDE28과 같은 테스트는 중간 버스트가 본질적으로 역동적임을 확인할 수 있는 반면 dPDA29,30 또는 H2MM31을 포함한 분석은 상호 변환 속도를 결정할 수 있습니다. BVA 및 2CDE용 Jupyter 노트북은 FRETBursts26 웹 사이트에서 사용할 수 있으며 MATLab 기반 소프트웨어 ^PAM32는 BVA, 2CDE 및 PDA 분석을 실행할 수 있습니다.

공초점 단일 분자 FRET는 TIRF보다 훨씬 더 곧 살았던 상태 (~1 ms)를 쉽게 관찰 할 수 있습니다. 그러나, 확산에 의해 제한되는 짧은 관측 시간은 분자 기록을 주지 않으며, 표면 고정 실험이 할 수 있는 방식으로 더 이상 거주 시간 또는 복잡한 전환 네트워크를 결정할 수 없습니다.

프로토콜은 매우 낮은 농도에서 분자를 자유롭게 확산측정하므로 동일한 분자에서 분자 내 거리를 측정할 때 가장 잘 작동합니다. 두 분자의 _Kd가 실험(~100 pM)에 요구되는 낮은 작업 농도에서 상당한 양으로 존재하는 복합체가 충분히 낮을 때 과도 결합 분자 사이의 분자 간 거리를 측정할 수 있다. Kd가 이것보다 훨씬 높으면, 노래로 표지된 분자만 볼 수 있습니다. 이 문제는 미세 유체학을 사용하여 두 개의 라벨이 부착된 구성 요소를 고농도로 혼합한 다음 복잡한 해리^33,34 전에 목표를 빠르게 희석하고 흐르면 극복할 수 있습니다.

단일 분자 수준에서 FRET 효율성을 측정하는 것은 앙상블 실험에서 평균이 될 이질적인 하위 집단에 알기 때문에 앙상블 기술에 비해 상당한 이점이 있습니다. 또한 ALEX를 갖춘 단일 분자 FRET는 정확한 FRET 효율성에 대한 액세스를 제공하므로 정확한 거리로 변환할 수 있습니다. 이를 통해 상대 거리 변화를 단순히 조사하는 대신 보다 자세한 구조 정보를 결정할 수 있습니다. smfBox는 이러한 모든 이점과 기능을 제공하지만 공초점 ^smFRET23이 가능한 유사한 상용 현미경보다 훨씬 낮은 예산으로 구성될 수 있습니다.

smfBox는 smFRET 기술에 대한 진입장벽이 훨씬 낮기 때문에 연구원들이 형성적 변화를 측정할 수 있게 해주며, 단백질과 핵산 내및 핵산 사이의 정확한 거리7,8,9,10,11,35를 측정할 수 있습니다.

Materials

Amino modified oligonucleotide	Eurogentec	N/A	May be ordered from various suppliers or synthesised; amino modification enables labeling with NHS-ester modified dyes
Avalanche photodiode (APD)	Excelitas	SPCM-AQRH-14	Two APDs are required for the smfBox setup
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck	A2153	System dependant; imaging buffer component (0.1 mg/mL in buffer)
Compact Laser Combiner	OMICRON	LightHUB-2	515 nm (80 mW) and 638 nm (100 mW) lasers
Coverglass	VWR	630-2742	Thickness: 0.17 ± 0.01 mm, LxW: 22×22 mm
Cy3B	Cytiva	PA63101	1 mg, PA63100 (5 mg), PA96106 (25 mg)
FRETBursts Python Package	N/A	N/A	Open-source python package for burst analysis of freely-diffusing single-molecule FRET data: https://fretbursts.readthedocs.io
Imaging Buffer	N/A		System dependant; 5 mM NaCl, 20 mM MgCl2, 5 mM Tris pH 7.5 and 0.1 mg/mL BSA
Immersion Oil	Olympus	IMMOIL-F30CC
Jupyter notebooks	Project Jupyter	N/A	Open-source web application to create and share documents that contain live code, equations, visualizations and text; data analysis notebooks for smfBox can be found in the SI
Lens Tissue	ThorLabs	MC-5	MC-50E is same item in bulk
Magnesium Chloride	Merck	M2670	System dependant; imaging buffer component (20 mM in buffer)
MilliQ/Ultrapure water	N/A
Nanopoistioner	Piezoconcept	FOC300	Nanopositioner for accurate positioning of microscope objective
NHS-ester modified ATTO-550	ATTO-TEC	AD 550-31	1 mg, AD 550-35 (5 mg)
NHS-ester modified ATTO-647N	ATTO-TEC	AD 647N-31	1 mg, AD 647N-35 (5 mg)
Objective lens	Olympus	N1480700	Olympus objective series from orignal smfBox discontinued; replaced by N5702300
OMICRON Control Center (OCC)- laser control center	OMICRON	N/A	v3.5.34 – OMICRON laser driver software
Press-To-Seal silicone isolator	Grace Bio-Labs	664201	8-9 mm Diameter x 1.7 mm Depth
smOTTER	N/A	N/A	Open-source acquisition software for the Craggs Lab smfBox: https://github.com/craggslab/smOTTER
Sodium Chloride	Merck	S7653	System dependant; imaging buffer component (5 mM in buffer)
Tris base	Merck	93362	System dependant; imaging buffer component (5 mM, pH 7.5 in buffer)
Type I ultrapure water	Merck	ZIQ7000T0	Milli-Q® IQ 7000 Ultrapure Water System