Oogsten en uitsplitsen: een over het hoofd geziene stap in onderzoek naar biofilmmethoden
Summary
Dit artikel beschrijft methoden die drie gangbare biofilmoogst- en desaggregatietechnieken op twee oppervlaktetypen demonstreren, robuustheidstests van een oogstmethode en minimale informatie om te overwegen bij het kiezen en optimaliseren van oogst- en desaggregatietechnieken om de reproduceerbaarheid te vergroten.
Abstract
Biofilmmethoden bestaan uit vier verschillende stappen: het kweken van de biofilm in een relevant model, het behandelen van de volwassen biofilm, het oogsten van de biofilm van het oppervlak en het uitsplitsen van de klonten en het analyseren van het monster. Van de vier stappen zijn oogsten en uitsplitsen het minst bestudeerd, maar niettemin kritisch bij het overwegen van het potentieel voor testbias. Dit artikel demonstreert veelgebruikte oogst- en desaggregatietechnieken voor biofilm die op drie verschillende oppervlakken wordt gekweekt. De drie biofilmoogst- en desaggregatietechnieken, verzameld uit een uitgebreid literatuuronderzoek, omvatten vortexing en ultrasoonapparaat, schrapen en homogeniseren, en schrapen, vortexen en ultrasoonapparaat. Twee oppervlaktetypen worden overwogen: hard niet-poreus (polycarbonaat en borosilicaatglas) en poreus (siliconen). Daarnaast geven we aanbevelingen voor de minimale informatie die moet worden opgenomen bij het rapporteren van de gevolgde oogsttechniek en een bijbehorende methode om te controleren op vertekening.
Introduction
De definitie van biofilm is de afgelopen decennia geëvolueerd en omvat microbiële associatie met een verscheidenheid aan biologische en / of niet-biologische oppervlakken, inclusief niet-cellulaire componenten1 die verschillende groei en genetische expressie vertonen2 binnen een matrix. Biofilm biedt bescherming tegen omgevingsstress zoals drogen en kan de werking van chemische desinfectiemiddelen minder effectief maken, wat resulteert in het overleven van microben. De overlevenden in een biofilm kunnen mogelijk een bron van pathogene micro-organismen vormen die een probleem voor de volksgezondheid zijn3.
Biofilmmethoden bestaan uit vier stappen, groei, behandeling, bemonstering (oogsten en uitsplitsen) en analyse. Groei, de eerste stap, waarbij de gebruiker de groeiomstandigheden van het organisme, temperatuur, media, enz. bepaalt, is de meest overwogen en gerapporteerde in de biofilmliteratuur4,5,6,7. De behandelingsstap evalueert antimicrobiële stoffen (bijv. ontsmettingsmiddelen) om hun werkzaamheid te bepalen, hetzij tegen een volwassen biofilm3,8,9, hetzij de antimicrobiële stof kan in het oppervlak worden opgenomen om het vermogen van het product om biofilmgroei te voorkomen of te verminderen te bepalen10. De derde stap, bemonstering, omvat stappen om de biofilm te oogsten van het oppervlak waarop deze groeide en om de verwijderde klonten uit te splitsen3,8,11. De vierde stap, analyse, kan levensvatbare celtellingen, microscopie, fluorescentiemetingen, moleculaire uitkomsten en/of een matrixcomponentbeoordeling8,9 omvatten. Beoordeling van gegevens geeft informatie over de uitkomst van een experiment. Van de vier is bemonstering vaak de meest over het hoofd geziene stap omdat het veronderstelt dat de gekozen biofilmoogst- en / of desaggregatietechniek 100% effectief is, vaak zonder verificatie11.
Planktonische suspensies van bacteriën, vaak beschouwd als homogeen, vereisen eenvoudige vortexing voorafgaand aan de analyse. Biofilms zijn echter complexe gemeenschappen die bestaan uit micro-organismen (prokaryote en/of eukaryote), exopolysacchariden, eiwitten, lipiden, extracellulair DNA en gastheercellen12. Stappen verder dan traditionele planktonische microbiologische kweekmethoden zijn nodig om biofilm adequaat van een oppervlak te oogsten en vervolgens uit te splitsen in een homogene eencellige suspensie. Een uitgebreid literatuuronderzoek (informatie die niet in deze publicatie is opgenomen) toonde aan dat de keuze van de verwijderings- en desaggregatietechniek afhankelijk is van een aantal factoren, waaronder soorten die aanwezig zijn in de biofilm, oppervlak waaraan de biofilm is bevestigd (niet-poreus of poreus), toegankelijkheid tot groeioppervlakken (gemakkelijk verwijderbare coupon of fysieke vernietiging van apparaten waarin de biofilm groeit), oppervlaktegeometrie (oppervlakte en vorm), dichtheid van biofilm op groeioppervlakken en beschikbare laboratoriumapparatuur.
Wanneer biofilm van een oppervlak wordt geoogst, is de resulterende celsuspensie heterogeen. Om deze niet-uniforme suspensie nauwkeurig te kunnen opsommen, moet deze worden opgesplitst in individuele cellen. Levensvatbare plaattellingen gaan ervan uit dat een kolonievormende eenheid afkomstig is van één bacterie. Als aggregaten van biofilm op het groeimedium worden geplaatst, is het onmogelijk om individuele cellen te onderscheiden, wat tot onnauwkeurige schattingen kan leiden. Bijvoorbeeld, tijdens het testen van de werkzaamheid van desinfectiemiddelen, als een behandeling biofilm zeer effectief van een oppervlak verwijdert in vergelijking met de controle, kan de logreductie kunstmatig groot lijken in vergelijking met de controle. Aan de andere kant zal een chemisch ontsmettingsmiddel dat biofilm op een oppervlak fixeert in vergelijking met de controle een lagere logreductie lijken te hebben11. Dit type scenario kan leiden tot een bevooroordeelde interpretatie van experimentele gegevens.
Ter voorbereiding op de publicatie heeft een literatuuroverzicht vastgesteld dat veel voorkomende benaderingen voor het oogsten en uitsplitsen van biofilm schrapen, swabben, ultrasoonapparaat, vortexing of een combinatie hiervan omvatten. Schrapen wordt gedefinieerd als fysieke verwijdering van biofilm van oppervlakken met een steriele stok, spatel of ander gereedschap. Swabbing verwijst naar het verwijderen van biofilm van oppervlakken met een wattenstokje of ander vast absorberend materiaal. Sonicatie verwijst naar verstoring van biofilm van oppervlakken via ultrasone golven die door water worden verspreid. Vortexing verwijst naar het gebruik van een mixer om een vloeibare vortex van het monster in een buis te bereiken. Homogenisatie maakt gebruik van roterende messen om geoogste biofilmklonten in een eencellige suspensie te scheren. In dit artikel presenteren we drie oogst- en desaggregatiemethoden voor twee verschillende oppervlaktetypen, hard/niet-poreus en poreus.
Er wordt een lijst met aanbevolen minimuminformatie verstrekt die onderzoekers moeten opnemen in de secties methoden van publicaties. We hopen dat het opnemen van deze informatie andere onderzoekers in staat stelt hun werk te reproduceren. Er is geen perfecte oogst- en uitsplitsingsmethode, daarom worden er ook aanbevelingen gegeven voor het controleren van de techniek.
Drie veelgebruikte methoden om biofilm van gemeenschappelijke groeioppervlakken te oogsten en af te splitsen, worden in dit artikel gedemonstreerd. Deze informatie zal onderzoekers in staat stellen om de algehele precisie en vooringenomenheid van een biofilmtestmethode beter te begrijpen. Beschreven methoden zijn als volgt: (1) Een Pseudomonas aeruginosa biofilm gekweekt op polycarbonaatcoupons (hard niet-poreus oppervlak) onder hoge vloeistofafschuiving in de CDC Biofilm Reactor wordt geoogst en uitgesplitst na een vijfstappencombinatie van vortexing en ultrasoonapparaat om biofilmoogst en -desaggregatie te bereiken (2) A P. aeruginosa biofilm gekweekt op borosilicaatglascoupons (hard niet-poreus oppervlak) in de druppelstroomreactor onder lage vloeistofafschuiving wordt geoogst en uitgesplitst met behulp van schrapen en homogenisatie (3) Een Escherichia coli-biofilm gekweekt in siliconenbuizen (poreus oppervlak) wordt geoogst en uitgesplitst met behulp van schrapen, gevolgd door ultrasoonapparaat en vortexing.
Protocol
Representative Results
Discussion
Minimale informatie voor oogst- en desaggregatiemethoden
Om reproduceerbare biofilmgegevens in de wetenschappelijke gemeenschap te creëren, is het noodzakelijk dat auteurs zoveel mogelijk details opnemen over elk van de groei-, behandelings-, bemonsterings- en analysestappen van een biofilmmethode. De standaardisatie van biofilmmethoden heeft geholpen bij dit streven, omdat het de onderzoeker in staat stelt om naar een specifieke methode en eventuele relevante wijzigingen te verwijzen. Veel artikelen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Danielle Orr Goveia, Blaine Fritz, Jennifer Summers en Fei San Lee bedanken voor hun bijdragen aan deze krant.
Materials
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N – 10 G – ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
References
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).
- ASTM International. ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International. , (2017).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews In Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Gomes, I. B., et al. Standardized reactors for the study of medical biofilms: a review of the principles and latest modifications. Critical Reviews in Biotechnology. 38 (5), 657-670 (2018).
- Goeres, D. M., et al., Simoes, M., et al. Design and fabrication of biofilm reactors. Recent Trends in Biofilm Sciences and Technology. , 71-88 (2020).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4 (5), 783-788 (2009).
- ASTM International. ASTM Standard E2871, Standard Test Method for Determining Disinfectant Efficacy Against Biofilm Grown in the CDC Biofilm Reactor Using the Single Tube Method. ASTM International. , (2019).
- Goeres, D. M., et al. Validation of a Biofilm Efficacy Test: The Single Tube Method. Journal of Microbiological Methods. , (2019).
- The development and validation of a standard in vitro method to evaluate the efficacy of surface modified urinary catheters. Theses and Dissertations at Montana State University Available from: https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149 (2019)
- Hamilton, M. A., Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M. Checking the Validity of the harvesting and Disaggregating Steps in Laboratory Tests of Surface Disinfectants. Journal of AOAC International. 92 (6), 1755-1762 (2009).
- Conlon, B. P., Rowe, S. E., Lewis, K., Donelli, G. Persister Cells in Biofilm Associated Infections. Biofilm-based Healthcare-associated Infections. , (2015).
- ASTM International. ASTM Standard E2647, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow Biofilm Reactor with Low Shear and Continuous Flow. ASTM International. , (2020).
- Rosenberg, M., Azevedo, N., Ivask, A. Propidium iodide staining underestimates viability of adherent bacterial cells. Scientific Reports. , (2019).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Manuira-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. , (2015).
- Kobayashi, N., Bauer, T. W., Tuohy, M. J., Fujishiro, T., Procop, G. W. Brief Ultrasonication Improves Detection of Biofilm-formative Bacteria Around a Metal Implant. Clinical Orthopaedics and Related Research. 457, 210-213 (2007).
- Lourenco, A., et al. Minimum information about a biofilm experiment (MIABiE), standards for reporting experiments and data on sessile microbial communities living at interfaces. Pathogens and Disease. , 1-7 (2014).
- Nascentes, C. C., Korn, M., Sousa, C. S., Arruda, M. A. Z. Use of Ultrasonic Baths for Analytical Applications: A New Approach for Optimisation Conditions. Journal of Brazilian Chemical Society. 12 (1), 57-63 (2001).
- Elma GmbH & Co. KG TI-H Ultrasonic Cleaning Units: Operating Instructions. Elma GmbH & Co. , (2009).
- Stamper, D. M., Holm, E. R., Brizzolara, R. A. Exposure times and energy densities for ultrasonic disinfection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus avium and sewage. Journal of Environmental Engineering and Science. 7 (2), 139-146 (2008).
- Suslick, K. S. Sonochemistry. Science. 247 (4949), (1990).
