Здесь представлен простой протокол направленной дифференцировки гемогенных эндотелиальных клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека примерно за 1 неделю.
Кровеносные сосуды повсеместно распределены во всех тканях организма и выполняют разнообразные функции. Таким образом, получение зрелых эндотелиальных клеток сосудов, которые выстилают просветы кровеносных сосудов, из плюрипотентных стволовых клеток человека имеет решающее значение для множества приложений тканевой инженерии и регенерации. In vivo первичные эндотелиальные клетки получены из мезодермальной линии и указаны для конкретных подтипов, включая артериальные, венозные, капиллярные, гемогенные и лимфатические. Гемогенные эндотелиальные клетки представляют особый интерес, потому что во время развития они дают начало кроветворным стволовым и прогениторным клеткам, которые затем генерируют все линии крови на протяжении всей жизни. Таким образом, создание системы генерации гемогенных эндотелиальных клеток in vitro даст возможность изучить переход от эндотелия к кроветворению и может привести к производству ex vivo продуктов крови человека и снижению зависимости от человеческих доноров. Хотя существует несколько протоколов для получения предшественников и первичных эндотелиальных клеток, генерация хорошо охарактеризованных гемогенных эндотелиальных клеток из стволовых клеток человека не была описана. Здесь представлен способ получения гемогенных эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека примерно за 1 неделю: протокол дифференцировки с примитивными полосовыми клетками, образованными в ответ на ингибитор GSK3β (CHIR99021), затем индукция линии мезодермы, опосредованная bFGF, за которой следует развитие первичных эндотелиальных клеток, способствующее развитию BMP4 и VEGF-A, и, наконец, гемогенная спецификация эндотелиальных клеток, индуцированная ретиноевой кислотой. Этот протокол дает четко определенную популяцию гемогенных эндотелиальных клеток, которые могут быть использованы для дальнейшего понимания их молекулярной регуляции и перехода эндотелия в кроветворение, что может быть применено к последующим терапевтическим приложениям.
Эндотелиальные клетки (ЭК) представляют собой гетерогенную популяцию клеток, которые выполняют множество функций по всему телу человека и в инженерных тканях. В дополнение к поддержке и регулированию других типов клеток (например, кардиомиоцитов1, остеобластных клеток2), эти функции включают формирование селективного барьера между кровью и тканями и содействие в формировании тканей3. Дифференциация зрелых ЭК во время нормального развития требует разнообразных сигнальных путей. Первичные ЭК получают из предшественников мезодермы, а затем указываются на зрелые артериальные, венозные, капиллярные и лимфатические фенотипы4. Кроме того, небольшое подмножество ЭК в внеэмбрионном желтковом мешке и эмбриональной области Аорта-Гонад-Мезонефрос (АГМ) также специфично становится гемогенными ЭК, которые дают начало гемопоэтическим стволовым и прогениторным клеткам (ГСПЦ), которые мигрируют в печень плода и костный мозг плода, где они остаются постнатально и генерируют все типы клеток крови на протяжении всей жизни4. Разнообразный диапазон фенотипов ЕС необходим для развития и поддержания всех тканей.
Таким образом, ЭК и их производные являются важнейшими компонентами исследований, направленных на моделирование и выяснение механизмов развития человека и/или заболеваний, а также регенеративной медицины и тканевой инженерии 5,6,7,8. Однако основным ограничением для этих типов исследований является отсутствие первичных человеческих ЭК в необходимом количестве. Было подсчитано, что для большинства терапевтических применений6 потребуется минимум 3 х 108 ЭК. Для решения этой проблемы было предложено использовать человеческие эмбриональные стволовые клетки (hESCs) и индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs) из-за их разнообразного потенциала линии и их способности генерировать большое количество потомства 6,9.
Действительно, полезность клеток, полученных из hESCs или hiPSCs, была продемонстрирована в многочисленных исследованиях, ориентированных на моделирование заболеваний и скрининг лекарств 10,11,12. Технология Organ-on-a-Chip (OOC) была использована для более точного повторения физиологии человеческого тела путем интеграции клеток и тканей в трехмерные каркасы. Кроме того, соединение нескольких отдельных ООК (так называемый body- или human-on-a-chip, BOC/HOC) может быть выполнено с помощью микрофлюидики, чтобы обеспечить перекрестные помехи между интересующими органами 13,14,15. Поддерживающие ткани, такие как сосудистая система, являются критическими компонентами ООК и БОК/ГОК; включение сосудистой системы позволяет транспортировать питательные вещества, кислород и паракринные факторы по всем тканям, тем самым способствуя необходимому тканеспецифическому микроокружению 3,12. Таким образом, методы получения зрелых человеческих ЭК, таких как артериальные, венозные, лимфатические и гемогенные ЭК, имеют решающее значение для продвижения этих подходов тканевой инженерии.
Было опубликовано несколько протоколов, подробно описывающих этапы получения первичных или прародительных ЕС человека из hESCs или hiPSCs 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Многие из этих протоколов основаны на формировании эмбриоидного тела (EB) или совместной культивировании ЭСК / ИПСК с мышиным фидерным слоем стромальных клеток. Эти стратегии, как правило, являются сложными и трудоемкими, с низким выходом ЕС и / или загрязнением человеческих ЭК мышиными клетками. Протоколы, которые полагаются строго на 2D-культуру без использования стромальных клеток, часто требуют длительных индукции, используют сложные комбинации факторов роста и / или ингибиторов для индукции, имеют длительные периоды расширения после разделения клеток или комбинацию этих факторов. Углубление знаний о сигнальных путях и факторах, участвующих в выведении зрелых типов EC in vivo, обеспечивает основу для простого и надежного протокола дифференциации in vitro.
Ранее были определены ключевые роли сигнальных путей Notch и Ретиноевой кислоты (РА) в спецификации мышиных артериальных и гемогенных ЭК, соответственно, во время развития. Сигнальный путь Notch играет несколько ролей в спецификации и поддержании артериального фенотипа EC. Работа с использованием модели васкуляризации сетчатки мышей определила путь, в котором напряжение сдвига жидкости индуцирует сигнальную ось Notch-Cx37-p27, способствуя остановке клеточного цикла G1, что позволяет артериальную спецификацию EC27. Было высказано предположение, что состояния клеточного цикла играют определенную роль в принятии решений о судьбе клеток, предоставляя различные окна возможностей, в которых клетки восприимчивы к определенным сигналам, которые могут индуцировать экспрессию генов и фенотипические изменения28. Эта остановка G1, опосредованная Notch, позволила экспрессировать гены, обогащенные артериальными ЭК, включая ephrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 и Notch 4 (рассмотрено в29,30). Также было показано, что гемогенная спецификация ЕС продвигается in vivo через передачу сигналов РА31,32. Дополнительные исследования показали, что после передачи сигналов РА экспрессия c-Kit и Notch повышает регуляцию p27, что обеспечивает гемогенную спецификацию в мышином желточном мешке и AGM33. Мышиные гемогенные ЭК могут быть минимально идентифицированы экспрессией как эндотелиальных (т.е. CD31, KDR), так и кроветворных (т.е. c-Kit, CD34) маркеров4. Наконец, гемогенные ЭК претерпевают эндотелиальный переход в кроветворный переход (EHT) с образованием HSPC, которые могут дать начало всем типам клеток крови 4,34,35.
Недавняя работа проверила, может ли эта же иерархия сигнализации способствовать гемогенной спецификации ЕС человека. Для этого был разработан протокол 2D-культуры без сыворотки и кормушки для получения гемогенных ЭК из гЭСК, и эти гемогенные ЭК были охарактеризованы на уровне одной клетки как CD31 + KDR + c-Kit + CD34 + VE-Cadherin– CD45–. В этом исследовании также использовался репортер Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI), который идентифицирует различные состояния клеточного цикла, используя H9-hESCs, которые экспрессируют конструкцию репортера FUCCI (H9-FUCCI-hESC)36. В исследованиях с этими клетками было продемонстрировано, что РА способствует ранней остановке клеточного цикла G1 в ЭК, а раннее состояние G1 позволяет гемогенную спецификацию in vitro37. Здесь представлен подробный протокол дифференцировки этих гемогенных эндотелиальных клеток человека и анализы, подтверждающие их идентичность. Этот простой метод обеспечивает полезные средства генерации этого специализированного подмножества ЭК для будущих исследований механизмов развития клеток крови человека.
В настоящем описаны этапы получения гемогенных эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека примерно за 1 неделю с использованием мышиной питательной и бессывороточной 2D-культуральной системы (рисунок 1). Этот протокол расширяет метод, описанный Sri…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была частично поддержана грантами NIH HL128064 и U2EB017103. Дальнейшую поддержку оказал грант CT Innovations 15-RMB-YALE-04.
15 cm dishes | Corning | 430599 | tissue culture treated |
35 mm dishes | Corning | 430165 | tissue culture treated |
6-well plates | Corning | 3516 | tissue culture treated |
Antimicrobial reagent Brand Name: Normocin |
Invitrogen | ant-nr-1 | |
bFGF | R&D systems | 233-FB-025 | use at 50 ng/mL |
BMP4 | BioLegend | 595202 | use at 25 ng/mL |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-1 | |
Cell Detatchment Solution Brand Name: vAccutase |
Stemcell Technologies | 7920 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
Dispase | Stemcell Technologies | 7913 | |
DLL4 | R&D systems | 1506-D4/CF | recombinant human; use at 10 μg/mL |
DMEM:F12 | Gibco | 11320-033 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
Endothelial cell growth medium Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2) |
Lonza | CC-3162 | |
FACS tubes | Corning | 352235 | polystyrene round bottom with filter cap |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
Fibronectin | ThermoFisher Scientific | 33016015 | use at 4 mg/cm2 |
GSK3i/CHIR99021 | Stemgent | 04-0004-02 | 10 mM stock; use at 5 μM |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175-095 | |
Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
Matrix protein Brand Name: Matrigel |
Corning | 356230 | Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein. |
Methylcellulose-based medium Brand Name: MethoCult H4435 Enriched |
Stemcell Technologies | 4435 | |
Pluripotent stem cell differentiation medium Brand Name: STEMdiff APEL 2 |
Stemcell Technologies | 5270 | |
Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI | WiCell | WA09 (H9), WA01 (H1) | human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier's lab at Cambridge Stem Cell Institute |
Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH) | Gibco | 12040077 | |
Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625-50mg | use at 0.5 μM |
Reverse transcription master mix Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix |
BioRad | 1708840 | |
RNA extraction kit Brand Name: RNeasy Mini Kit |
Qiagen | 74104 | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS255-1 | |
Stem cell growth medium Brand Name: mTeSR1 |
Stemcell Technologies | 85850 | |
SYBR Green master mix Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix |
BioRad | 1725121 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25299956 | 0.25% |
VEGF165 (VEGF-A) | PeproTech | 100-20 | use at 50 ng/mL |
α-CD31-FITC | BioLegend | 303104 | 2 μg/mL* |
α-CD34-Pacific Blue | BioLegend | 343512 | 2 μg/mL* |
α-CD45-APC/Cy7 | BioLegend | 304014 | 2 μg/mL* |
α-c-Kit-APC | BioLegend | 313206 | 2 μg/mL* |
α-Flk-1-PE/Cy7 | BioLegend | 359911 | 2 μg/mL* |
α-VE-Cadherin-PE | BioLegend | 348506 | 2 μg/mL* |
* Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study. |