Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Hemojenik Endotel Hücrelerinin İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Yönlendirilmiş Farklılaşması

Published: March 31, 2021 doi: 10.3791/62391
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1,2, 1,2,3,4,5
1Department of Cell Biology, University of Virginia, 2Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Department of Medicine, Yale University School of Medicine, 4Department of Genetics, Yale University School of Medicine, 5Yale Cardiovascular Research Center, Yale University School of Medicine

Summary

Burada hemojenik endotel hücrelerinin insan pluripotent kök hücrelerinden yaklaşık 1 hafta içinde yönlendirilmiş farklılaşması için basit bir protokol sunulmaktadır.

Abstract

Kan damarları vücudun tüm dokularında her yerde dağılır ve çeşitli işlevleri yerine getirir. Bu nedenle, kan damarı lümenlerini hizalayan olgun vasküler endotel hücrelerinin insan pluripotent kök hücrelerinden türetilmesi, çok sayıda doku mühendisliği ve rejenerasyon uygulaması için çok önemlidir. İn vivo, primordiyal endotel hücreleri mezodermal soydan türetilir ve arteriyel, venöz, kılcal, hemojenik ve lenfatik dahil olmak üzere spesifik alt tiplere doğru belirtilir. Hemojenik endotel hücreleri özellikle ilgi çekicidir, çünkü gelişim sırasında, hematopoetik kök ve progenitör hücrelere yol açarlar ve bu da yaşam boyunca tüm kan soylarını üretir. Bu nedenle, in vitro hemojenik endotel hücreleri üretmek için bir sistem oluşturmak, endotelyal-hematopoetik geçişi incelemek için bir fırsat sağlayacaktır ve insan kan ürünlerinin ex vivo üretimine ve insan donörlerine olan bağımlılığın azalmasına neden olabilir. Progenitör ve primordiyal endotel hücrelerinin türetilmesi için çeşitli protokoller mevcut olsa da, insan kök hücrelerinden iyi karakterize edilmiş hemojenik endotel hücrelerinin üretimi tanımlanmamıştır. Burada, hemojenik endotel hücrelerinin insan embriyonik kök hücrelerinden yaklaşık 1 hafta içinde türetilmesi için bir yöntem sunulmaktadır: GSK3β inhibitörüne (CHIR99021) yanıt olarak oluşan ilkel çizgi hücrelerle bir farklılaşma protokolü, daha sonra bFGF'nin aracılık ettiği mezoderm soy indüksiyonu, ardından BMP4 ve VEGF-A tarafından teşvik edilen ilkel endotel hücre gelişimi ve son olarak retinoik asit tarafından indüklenen hemojenik endotel hücre spesifikasyonu. Bu protokol, moleküler regülasyonlarını ve endotelyal-hematopoetik geçişlerini daha iyi anlamak için kullanılabilecek iyi tanımlanmış bir hemojenik endotel hücresi popülasyonu verir ve bu da aşağı akış terapötik uygulamalarına uygulanma potansiyeline sahiptir.

Introduction

Endotel hücreleri (ECs), insan vücudunda ve mühendislik dokularında birden fazla işlevi yerine getiren heterojen bir hücre popülasyonudur. Diğer hücre tiplerini (yani, kardiyomiyositler1, osteoblastik hücreler2) desteklemeye ve düzenlemeye ek olarak, bu işlevler kan ve dokular arasında seçici bir bariyer oluşturmayı ve doku oluşumuna yardımcı olmayı içerir3. Normal gelişim sırasında olgun EC'lerin farklılaşması, çeşitli sinyal yolları gerektirir. Primordial EC'ler mezoderm progenitörlerinden türetilir ve daha sonra olgun arteriyel, venöz, kılcal ve lenfatik fenotiplere doğru belirtilir4. Ek olarak, ekstraembriyonik yumurta sarısı kesesi ve embriyonik Aort-Gonad-Mesonephros (AGM) bölgesindeki EC'lerin küçük bir alt kümesinin, fetal karaciğere ve fetal kemik iliğine göç eden, doğum sonrası kaldıkları ve yaşam boyunca tüm kan hücresi tiplerini ürettikleri hematopoetik kök ve progenitör hücrelere (HSPC'ler) yol açan hemojenik EC'ler haline geldiği belirtilmektedir4. EC fenotiplerinin çeşitliliği tüm doku gelişimi ve bakımı için gereklidir.

Bu nedenle, EC'ler ve türevleri, insan gelişimi ve / veya hastalığının mekanizmalarının modellenmesi ve aydınlatılmasının yanı sıra rejeneratif tıp ve doku mühendisliği uygulamalarının modellenmesi ve aydınlatılmasını amaçlayan çalışmaların kritik bileşenleridir 5,6,7,8. Bununla birlikte, bu tür çalışmalar için ana sınırlama, birincil insan EC'lerinin gerekli miktarda bulunmamasıdır. Terapötik uygulamaların çoğunluğu için en az 3 x 108 EC'nin gerekli olacağı tahmin edilmektedir6. Bu sorunu çözmek için, insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC'ler) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin (hiPSC'ler) kullanımı, çeşitli soy potansiyelleri ve çok sayıda soy üretme yetenekleri nedeniyle önerilmiştir 6,9.

Gerçekten de, hESC'lerden veya hiPSC'lerden türetilen hücrelerin yararlılığı, hastalık modellemesi ve ilaç taramasına odaklanan birçok çalışmada gösterilmiştir10,11,12. Organ-on-a-Chip (OOC) teknolojisi, hücreleri ve dokuları üç boyutlu iskelelere entegre ederek insan vücudunun fizyolojisini daha sadık bir şekilde özetlemek için kullanılmıştır. Ayrıca, birden fazla bireysel OOC'nin (vücut veya çip üzerinde insan, BOC / HOC olarak adlandırılan) bağlantısı,13,14,15 ilgili organlar arasında çapraz konuşmaya izin vermek için mikroakışkanlar aracılığıyla gerçekleştirilebilir. Vaskülatür gibi destekleyici dokular, OOC'lerin ve BOC / HOC'lerin kritik bileşenleridir; vaskülatür dahil etmek, besinlerin, oksijenin ve parakrin faktörlerin dokular boyunca taşınmasına izin verir, böylece gerekli dokuya özgü mikro ortamı teşvik eder 3,12. Bu nedenle, arteriyel, venöz, lenfatik ve hemojenik EC'ler gibi olgun insan EC'lerini türetme yöntemleri, bu doku mühendisliği yaklaşımlarını ilerletmek için çok önemlidir.

İnsan ilkel veya progenitör EC'lerinin hESC'lerden veya hiPSC'lerden türetilmesi için adımları detaylandıran birden fazla protokol yayınlanmıştır5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Bu protokollerin çoğu, embriyoid cisim (EB) oluşumuna veya stromal hücrelerin murin besleyici tabakası ile ESC'lerin / iPSC'lerin ortak kültürüne dayanır. Bu stratejiler, düşük EC verimi ve / veya insan EC'lerinin murin hücreleri ile kontaminasyonu ile zor ve zaman alıcı olma eğilimindedir. Stromal hücrelerin kullanımı olmadan kesinlikle 2D kültüre dayanan protokoller genellikle uzun indüksiyonlar gerektirir, indüksiyon için büyüme faktörlerinin ve / veya inhibitörlerin karmaşık kombinasyonlarını kullanır, hücre ayrılmasını takiben genleşme sürelerini uzatır veya bu faktörlerin bir kombinasyonuna sahiptir. Sinyal yolları ve olgun EC tiplerinin in vivo türetilmesinde rol oynayan faktörler hakkında bilgi edinmek, basit ve sağlam bir in vitro farklılaşma protokolü için zemin hazırlar.

Daha önce, geliştirme sırasında sırasıyla murin arteriyel ve hemojenik ECs'nin spesifikasyonunda Çentik ve Retinoik Asit (RA) sinyal yolakları için anahtar roller tanımlanmıştır. Çentik sinyal yolu, arteriyel EC fenotipinin spesifikasyonunda ve korunmasında birçok rol oynar. Murin retinal vaskülarizasyon modelini kullanarak yapılan çalışmalar, sıvı kesme stresinin bir Çentik-Cx37-p27 sinyal eksenini indüklediği ve arteriyel EC spesifikasyonunu sağlayan G1 hücre döngüsü durmasını teşvik eden bir yol tanımladı27. Hücre döngüsü durumlarının, hücrelerin gen ekspresyonunu ve fenotipik değişiklikleri indükleyebilecek belirli sinyallere alıcı olduğu farklı fırsat pencereleri sağlayarak hücre kaderi kararlarında rol oynadığı varsayılmıştır28. Bu Çentik aracılı G1 tutuklaması, ephrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 ve Notch 4 (29,30'da gözden geçirildi) dahil olmak üzere arteriyel EC'lerde zenginleştirilmiş genlerin ekspresyonunu sağladı. Ayrıca, hemojenik EC spesifikasyonunun RA sinyali31,32 aracılığıyla in vivo olarak desteklendiği gösterilmiştir. Ek çalışmalar, RA sinyallemesinin aşağı akışında, c-Kit ve Notch ekspresyonunun, murin yumurta sarısı kesesinde ve AGM33'te hemojenik spesifikasyonu sağlayan p27'yi yukarı regüle ettiğini tespit etmiştir. Murin hemojenik ECs, hem endotel (yani CD31, KDR) hem de hematopoetik (yani, c-Kit, CD34) belirteçlerin ekspresyonu ile minimal olarak tanımlanabilir4. Son olarak, hemojenik EC'ler, HSPC'leri oluşturmak için endotelyal-hematopoetik geçişe (EHT) uğrar ve bu da tüm kan hücresi tiplerine yol açabilir 4,34,35.

Son çalışmalar, aynı sinyal hiyerarşisinin insan hemojenik EC spesifikasyonunu destekleyip destekleyemeyeceğini test etti. Bunu yapmak için, hESC'lerden hemojenik ECs türetmek için serum ve besleyicisiz bir 2D kültür protokolü geliştirildi ve bu hemojenik EC'ler tek hücre seviyesinde CD31 + KDR + c-Kit + CD34 + VE-Kadherin-CD45- olarak karakterize edildi. Bu çalışma ayrıca, FUCCI muhabir yapısını (H9-FUCCI-hESC) ifade eden H9-hESC'leri kullanarak, farklı hücre döngüsü durumlarını tanımlayan Floresan Ubikitinasyon Hücre Döngüsü Göstergesi (FUCCI) raporlayıcısından da yararlanmıştır. Bu hücrelerle yapılan çalışmalarda, RA'nın ECs'de erken G1 hücre döngüsü tutuklamasını teşvik ettiği ve erken G1 durumunun in vitro37'de hemojenik spesifikasyonu sağladığı gösterilmiştir. Burada, bu insan hemojenik endotel hücrelerinin farklılaşması için ayrıntılı bir protokol ve kimliklerini doğrulayan tahliller sunulmaktadır. Bu basit yöntem, insan kan hücresi gelişimi mekanizmalarının gelecekteki çalışmaları için ECS'nin bu özel alt kümesini oluşturmak için yararlı bir araç sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Reaktifler ve reaktif hazırlama

NOT: Reaktiflerin bir listesi Malzeme Tablosunda verilmiştir.

  1. İnsan pluripotent kök hücre hatlarını elde edin: H1-hESC, H9-Fucci-hESC.
    NOT: Hemojenik EC'lerin üretimi H1 hücre hattında daha verimli olabilir.
  2. Matriks protein stoklarını hazırlayın: Matris proteinini önceden soğutulmuş 1.5 mL tüplere (buz üzerinde) Aliquot, böylece her tüp 1 mg matris proteini içerir. 1 mg matris proteini, iki adet 6 delikli plakanın (toplam 12 kuyu) tüm kuyularını kaplamak için yeterlidir. Alikotları kullanana kadar -20 ° C'de saklayın.
    NOT: Matriks proteini içeren tüm adımları buz üzerinde veya 4 ° C'de gerçekleştirin. Dondurulmuş matriks proteini şişesini gece boyunca 4 ° C'de buz üzerinde çözün. Çözüldükten sonra, içeriğin karıştırıldığından emin olmak için şişeyi döndürün. 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerini -20 °C'de en az 1 saat önceden soğutun ve alikotasyondan hemen önce buza aktarın.
  3. Matriks protein kaplı plakalar hazırlayın: 4 ° C'de buz üzerinde matris protein alikotlarını çözün. Buz üzerinde önceden soğutulmuş konik bir tüpe 12,5 mL buz gibi soğuk DMEM:F12 ekleyin. Önceden soğutulmuş pipet uçlarını kullanarak, bir alikot (1 mg) matris proteinini konik tüpe aktarın ve yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Aliquot 1 mL seyreltilmiş matris proteini, önceden soğutulmuş serolojik pipet kullanılarak önceden soğutulmuş 6 delikli plakaların (buz üzerinde) her bir kuyucuğuna. Plakaları döndürün ve sallayın, böylece tüm kuyu eşit şekilde kaplanır. Matriks proteininin katılaşmasını sağlamak için plakaları oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca inkübe edin. Plakaları parafilm ile sarın ve kullanana kadar 4 ° C'de saklayın. Matriks protein kaplı plakaları hazırlandıktan sonraki 2 hafta içinde kullanın.
    NOT: Hücrelerin rutin geçişi ve ilkel ve hemojenik endotel hücrelerine farklılaşması için matris protein kaplı 6 delikli plakaları kullanın. Tüm adımları buz üzerinde gerçekleştirin. 6 delikli plakaları, pipet uçlarını, serolojik pipetleri ve konik tüpleri kullanmadan önce -20 °C'de en az 1 saat önceden soğutun. Kullanıma hazır olduğunda bu eşyaları buza aktarın.
  4. 100 mL pluripotent kök hücre farklılaşma ortamına 5 mL PFHM ekleyerek baz farklılaşma ortamını hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
  5. 0,1 g BSA'yı 100 mL PBS'de çözerek %0,1 BSA-PBS hazırlayın. Filtre, 0,22 μm'lik bir filtreden geçerek BSA-PBS'yi sterilize eder ve 4 °C'de saklar.
  6. Stok HCl (12 M) 1:2.400'ü suyla seyrelterek 5 mM HCl hazırlayın. NaOH kullanarak pH'ı 3,0'a ayarlayın. Filtre, 0,22 μm'lik bir filtreden geçerek çözeltiyi sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın.
  7. bFGF, BMP4, VEGF-A, Retinoik Asit (RA) ve DLL4 stoklarını hazırlayın.
    1. bFGF: Liyofilize pudrayı %0.1 BSA-PBS'de 100 μg/mL'ye yeniden oluşturur. Aliquot ve -20 ° C'de saklayın. bFGF stoklarını hazırlıktan sonraki 3 ay içinde kullanın. Kullanmadan hemen önce alikotları çözün.
    2. BMP4: Liyofilize tozu 5mM HCl, pH 3.0'da 1 mg / mL'ye yeniden oluşturun. %0,1 BSA-PBS'de 50 μg/mL'ye kadar seyreltin. Aliquot ve -20 ° C'de saklayın. BMP4 stoklarını hazırlıktan sonraki 3 ay içinde kullanın. Kullanmadan hemen önce alikotları çözün.
    3. VEGF-A: Liyofilize tozu dH2O'da 1 mg / mL'ye yeniden oluşturur. %0,1 BSA-PBS'de 100 μg/mL'ye kadar seyreltin. Aliquot ve -20 ° C'de saklayın. VEGF-A stoklarını hazırlıktan sonraki 3 ay içinde kullanın. Kullanmadan hemen önce alikotları çözün.
    4. RA: DMSO'da liyofilize tozu 100 mM'ye kadar yeniden oluşturur. Aliquot ve -80 ° C'de saklayın. RA stoklarını hazırlıktan sonraki 1 ay içinde kullanın. Kullanmadan hemen önce alikotları çözün.
      NOT: RA stoklarını ışıktan koruyun.
    5. DLL4: Liyofilize tozu PBS'de 1 mg / mL'ye yeniden oluşturur. Aliquot ve -20 ° C'de saklayın. DLL4 stoklarını hazırlandıktan sonraki 12 ay içinde kullanın. Kullanmadan hemen önce alikotları çözün.
  8. VEGF-A ve BMP4'ü baz farklılaşma ortamında (adım 1.4) seyrelterek kullanımdan hemen önce endotel hücre farklılaşma ortamını hazırlayın, böylece nihai konsantrasyonlar sırasıyla 25 ng / mL ve 50 ng / mL olur.
  9. DMSO'daki 100 mM stok 1:1.000'i 100 μM'ye seyrelterek kullanımdan hemen önce çalışan RA'yı hazırlayın.
    NOT: Çalışan RA'yı ışıktan koruyun.
  10. Kullanımdan hemen önce VEGF-A, BMP4 ve çalışan RA'yı baz farklılaşma ortamında (adım 1.4) seyrelterek hemojenik endotel hücre farklılaşma ortamını hazırlayın, böylece nihai konsantrasyonlar sırasıyla 25 ng / mL, 50 ng / mL ve 0.5 μM olur.
  11. % 10 FBS içeren HBSS yaparak antikor boyama tamponunu hazırlayın ve 1:500 seyreltilmiş antimikrobiyal reaktif ile takviye edin. Arabelleği steril olarak filtreleyin ve hemen kullanın.
  12. % 1 FBS içeren HBSS yaparak hücre sıralama tamponunu hazırlayın ve 1:500 seyreltilmiş antimikrobiyal reaktif ile takviye edin. Arabelleği steril olarak filtreleyin ve hemen kullanın.
  13. 5 mg liyofilize fibronektine 5 mL steril su ekleyerek 1 mg / mL fibronektin stokları hazırlayın. Aliquot ve -20 ° C'de saklayın. Liyofilize ürün etiketinde son kullanma tarihinden önce fibronektin stoklarını kullanın. Kullanmadan hemen önce alikotları çözün.
  14. Fibronektin kaplı 35 mm'lik tabakları hazırlayın. Fibronektin stoklarını (1 mg / mL) steril suda 4 μg / mL'ye seyreltin. Her yemeğe bu fibronektin kaplama çözeltisinden 1 mL ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika ila 1 saat arasında inkübe edin. Kaplamanın hemen ardından bulaşıkları kullanın.
  15. Üreticinin talimatlarını izleyerek metilselüloz bazlı ortamın 3 veya 4 mL alikotlarını hazırlayın. Alikotları kullanana kadar -20 ° C'de saklayın. Metilselüloz bazlı orta boy alikotları, stok ürün etiketinde belirtilen son kullanma tarihinden önce kullanın. Kullanmadan hemen önce alikotları çözün.
  16. Rekombinant insan DLL4 stoğunu PBS'de 10 μg/mL'lik son konsantrasyona kadar seyrelterek DLL4 kaplama çözeltisini hazırlayın.
  17. Endotel hücre büyüme ortamını üreticinin talimatlarına göre hazırlayın ve saklayın.
  18. %0.1 BSA içeren PBS yaparak akış sitometri analiz tamponunu hazırlayın. Arabelleği steril olarak filtreleyin ve kullanana kadar 4 °C'de saklayın.

2. Hücre kültürü ve hESC'lerin geçişi

  1. Matriks protein kaplı plakaların, kök hücre büyüme ortamının ve DMEM: F12'nin oda sıcaklığına ısınmasına izin verin.
  2. Kök hücre büyüme ortamındaki (2 mL / kuyu) hESC hücre hatlarını, matris protein kaplı 6 delikli plakalar üzerinde,% 5 CO2 inkübatöründe büyütün.
  3. Hücreleri günlük olarak kontrol edin ve farklılaşmış hücreleri bir p200 pipet ucu kullanarak plakadan yavaşça kazıyarak gerektiği gibi çıkarın.
    NOT: Diferansiye hücreler kolonilerin çevresinde görünecektir. Kültürdeki farklılaşmış hücrelerin örnekleri için kök hücre büyüme ortamı ürün el kitabına bakın.
  4. Hücreleri% 70 -% 80 akıcılığa ulaştıklarında geçirin. Hücreleri geçmek için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
    NOT: Hücreler, farklılaşmanın artması durumunda% 70-80 akıcılığa ulaşmadan önce bölünmelidir.
    1. Hücrelerin üzerindeki ortamı çıkarın ve kuyucuk başına 1 mL DMEM: F12 ile nazikçe yıkayın.
    2. Kuyu başına 1 mL DMEM:F12 ekleyin.
    3. Kuyu başına 160 μL / mL Dispase ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatöründe 45 dakika boyunca inkübe edin.
    4. Dispase inkübasyonunu takiben, hücreleri kaldırmak için kuyucuk başına ilave 1 mL DMEM: F12 ve hafifçe pipet ekleyin.
      NOT: Hücreleri tek hücreli bir süspansiyonda ayırmaktan kaçının. Hücreleri küçük kümeler halinde geçirin.
    5. Hücreleri 12 mL DMEM: F12 içeren konik bir tüpe aktarın ve hücrelerin yerçekimi ile yerleşmesine izin verin (~ 5-10 dakika).
    6. Süpernatantı çıkarın ve küçük hücre kümeleri elde etmek için peleti kaldırılan hücrelerin kuyusu başına 0.5 mL kök hücre büyüme ortamında yavaşça yeniden askıya alın.
      NOT: Hücreleri tek hücreli bir süspansiyonda ayırmaktan kaçının. Hücreleri küçük kümeler halinde geçirin.
    7. Matriks protein kaplama çözeltisini, hazırlanan matris protein kaplı plakanın kuyucuklarından aspire edin ve kuyucuk başına 1.5 mL kök hücre büyüme ortamı ekleyin.
    8. Hazırlanan matris protein kaplı plakanın her bir kuyucuğuna istenen miktarda yeniden askıya alınmış hücre (adım 2.4.6) ekleyin.
    9. Plakayı 37 °C,% 5 CO2 inkübatörde inkübe edin. Ortamı her 24 saatte bir taze kök hücre büyüme ortamına değiştirin.

3. hESC'lerin ilkel endotel hücrelerine farklılaşması

  1. Gün -1: Yukarıda bölüm 2'de açıklandığı gibi hücrelerin kültürü ve geçişi. Hücreleri (adım 2.4.6) santimetre kare başına yaklaşık 2 küme yoğunluğunda küçük kümeler halinde (~ 50 μm)tohumlayın 38.
    NOT: Tohum yoğunluğunu değerlendirin ve gerekirse ampirik olarak rafine edin.
  2. 0. Gün: Hücreleri tohumladıktan 24 saat sonra, ortamı her bir kuyucuktan aspire edin ve hücreleri kuyucuk başına 1 mL DMEM: F12 ile nazikçe yıkayın. Her bir kuyucuğa 5 μM GSK3i (CHIR99021, taze eklenmiş) içeren baz farklılaşma ortamından 1 mL ekleyin ve 24 saat (37 °C, %5 CO2) kuluçkaya yatırın.
    NOT: Tüm yıkama adımları için, belirtilen yıkama ortamını plakanın duvarına iyice pipetleyerek yavaşça plakaya ekleyin. Plakayı yavaşça döndürün, böylece kuyunun tüm yüzeyi yıkama ortamı ile kaplanır. Yıkama ortamı saat altı konumunda birikecek şekilde plakayı hafifçe eğin ve yıkama ortamını dikkatlice aspire edin.
  3. 1. Gün: Ortamı her bir kuyucuktan aspire edin ve hücreleri kuyucuk başına 1 mL DMEM: F12 ile nazikçe yıkayın. Her bir kuyucuğa 50 ng/mL bFGF (taze, dondurulmuş stoktan 1:2.000 ilave edilir) içeren baz farklılaştırma ortamından 1 mL ekleyin ve 24 saat (37 °C, %5 CO2) inkübe edin.
  4. 2. Gün: Ortamı her bir kuyucuktan aspire edin ve hücreleri kuyucuk başına 1 mL DMEM: F12 ile nazikçe yıkayın. Her bir oyuğa 1 mL endotel hücre farklılaşma ortamı ekleyin ve 24 saat (37 °C,% 5 CO2) inkübe edin.
  5. 3. Gün: Hücrelerin üzerindeki ortamı, kuyucuk başına 1 mL taze hazırlanmış endotel hücre farklılaşma ortamı ile değiştirin ve 24 saat (37 ° C,% 5 CO2) inkübe edin.
  6. 4. Gün: Hücrelerin üzerindeki ortamı, kuyucuk başına 1 mL taze hazırlanmış endotel hücre farklılaşma ortamı ile değiştirin ve 24 saat (37 ° C,% 5 CO2) inkübe edin.
  7. 5. Gün: FACS, EC fenotipini değerlendirmek (bölüm 4-5) veya kültürde kalmak ve hemojenik endotel hücrelerine (bölüm 6) doğru farklılaşmak için hücreleri saflaştırır.

4. İlkel endotel hücrelerinin FACS saflaştırılması

  1. Hücrelerin üzerindeki ortamı aspire edin ve kuyucuk başına 1 mL DMEM: F12 ile bir kez nazikçe yıkayın.
  2. Kuyucuk başına 1 mL hücre ayrılma çözeltisi ekleyin ve hücreleri 37 ° C,% 5 CO 2 inkübatöründe veya hücreler ayrışana kadar12 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Ayrışmış hücreleri 12 mL DMEM:F12 ve pelet içeren konik bir tüpe 5 dakika, 1.000 x g santrifüjleme ile aktarın.
  4. Süpernatantı çıkarın ve yıkamak için peleti 12 mL DMEM: F12 içinde yeniden askıya alın.
  5. Hücreleri 5 dakika, 1.000 x g santrifüjleme ile toplayın.
  6. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini buz gibi soğuk antikor boyama tamponunda yeniden askıya alın ve hücreleri sayın. Buz gibi soğuk antikor boyama tamponu kullanarak konsantrasyonu 1 x 105 hücre/mL'ye ayarlayın.
  7. Antikor boyama için hücreleri, her biri 1 x 105 hücre / mL'de en az 600 μL hücre içeren buz üzerindeki mikrosantrifüj tüplerine eşit olarak bölün.
    NOT: İlkel EC'lerin boyanması için dört tüp hücre gereklidir: boyanmamış kontrol, CD31 tek antikor kontrolü, CD45 tek antikor kontrolü ve hem CD31 hem de CD45 antikorlarını içeren numune. Antikorlar hakkında bilgi Malzeme Tablosunda verilmiştir.
  8. Hücreleri içeren tüplere uygun şekilde antikorlar ekleyin ve buz üzerinde kuluçkaya yatırın ve 30 dakika boyunca ışıktan koruyun.
    1. Lekesiz kontrol: Herhangi bir antikor eklemeyin.
    2. CD31 tek antikor kontrolü: Sadece CD31 antikoru ekleyin.
    3. CD45 tek antikor kontrolü: Sadece CD45 antikoru ekleyin.
    4. Örnek: Hem CD31 hem de CD45 antikorlarını ekleyin.
      NOT: Numunedeki nihai antikor konsantrasyonu ve floresan konjugatlar, kullanılan spesifik antikorlara ve hücre sıralayıcısına göre optimize edilmelidir.
  9. 4 °C'lik bir masa üstü mikrosantrifüjde santrifüjleme yoluyla hücreleri 1.000 x g'da 5 dakika boyunca pelet edin.
  10. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletlerini 600 μL buz gibi soğuk ayıklama tamponunda yeniden askıya alın.
  11. Numuneleri 5 mL FACS tüplerinin ağ filtre kapaklarından süzün ve hücreleri anında FACS için ışıktan korunan buz üzerinde saklayın.
  12. Aşağıdaki adımları uygulayarak ilkel endotel hücrelerini (CD31 + CD45-) elde edin.
    1. CD45-negatif hücre popülasyonunu ve kapısını (CD45-) tanımlayın.
    2. (CD45-), CD31-pozitif (CD31+) hücre popülasyonunu tanımlayın ve hücreleri 6 mL buz gibi soğuk hücre sıralama tamponuna ayırın. Bu hücreleri aşağı akış uygulamaları için kullanın (bkz. bölüm 5).

5. İlkel endotel hücre fenotipini doğrulamak için tahlil

  1. 6 delikli bir plakanın üç kuyusunu 37 °C, %5 CO2 inkübatörde 30 dakika boyunca 1 mL/kuyu DLL4 kaplama çözeltisi ile kaplayın. Kontrol olarak, plakanın diğer üç kuyusunu 1 mL/kuyu PBS ile alay edin.
  2. DLL4 kaplama çözeltisini ve PBS'yi aspire edin ve kuyu başına 2 mL endotel hücresi büyüme ortamında 25.000 sıralanmış ilkel endotel hücresini (bkz. adım 4.12) plakalayın.
  3. Hücreleri 37 °C,% 5 CO 2 inkübatörde24 saat boyunca inkübe edin.
  4. Hücrelerin üzerindeki ortamı aspire edin ve 2 mL / kuyucuk PBS ile bir kez yıkayın. Hücreleri qPCR veya akış sitometrisi ile analiz edin (FUCCI yapısını ifade eden hücreler için).
    1. Hücreleri qPCR ile çözümlemek için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
      1. Hücrelerin üzerindeki sıvıyı aspire edin ve üreticinin protokolüne göre bir RNA ekstraksiyon kiti kullanarak hücrelerdeki RNA'yı izole edin.
      2. Üreticinin protokolüne göre ters transkripsiyon ana karışımı ile ters transkripsiyon reaksiyonları gerçekleştirin.
      3. Üreticinin protokolüne göre bir SYBR Green ana karışımı ile qPCR reaksiyonları gerçekleştirin.
        NOT: Kullanılan astarlar (EFNB2, GJA5, GJA4, NR2F2, EPHB4, HEY2) Tablo 1'de listelenmiştir.
    2. FUCCI yapısını akış sitometrisi ile ifade eden hücreleri analiz etmek için aşağıdaki adımları uygulayın.
      1. Sıvıyı hücrelerin üzerine aspire edin ve 500 μL / kuyu% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin.
      2. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatöründe ~ 5 dakika kaldırılana kadar inkübe edin.
      3. Hücreleri bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri 4 ° C'lik bir mikrosantrifüjde 1.000 x g'da 5 dakika boyunca pelet edin.
      4. Süpernatantı aspire edin ve peleti 500 μL buz gibi soğuk akış sitometri analiz tamponunda yeniden askıya alın.
      5. Numuneleri 5 mL'lik bir FACS tüpünün ağ filtre kapağından süzün ve anında akış sitometrisi analizi için hücreleri ışıktan korunan buz üzerinde saklayın.
      6. Erken G1 (renksiz), geç G1 (mCherry+/mVenüs-), G1/S (mCherry+/mVenüs+) ve S/G2/M (mCherry-/mVenüs+) değerlerinde DLL4 ve PBS kontrolüne karşı kaplanan hücrelerin yüzdesini analiz edin.

6. hESC'lerin hemojenik endotel hücrelerine farklılaşması

NOT: Hücreleri, yukarıda bölüm 3.1-3.6'da açıklandığı gibi 4. gün ilkel EC'lerine göre ayırt edin.

  1. 5. Gün: Hücrelerin üzerindeki ortamı aspire edin ve hücreleri kuyucuk başına 1 mL DMEM: F12 ile nazikçe yıkayın. Kuyu başına 1 mL taze hazırlanmış hemojenik endotel hücre farklılaşma ortamı ekleyin ve 24 saat (37 °C,% 5 CO2) inkübe edin.
  2. 6. Gün: Hücrelerin üzerindeki ortamı, kuyucuk başına 1 mL taze hazırlanmış hemojenik endotel hücre farklılaşma ortamı ile değiştirin ve 24 saat (37 ° C,% 5 CO2) inkübe edin.
  3. 7. Gün: Hücrelerin üzerindeki ortamı, kuyucuk başına 1 mL taze hazırlanmış hemojenik endotel hücre farklılaşma ortamı ile değiştirin ve 24 saat (37 ° C,% 5 CO2) inkübe edin.
  4. 8. Gün: FACS, hemojenik endotel hücrelerini izole eder (bkz. bölüm 7).

7. FACS-hemojenik endotel hücrelerinin izolasyonu

  1. Hücreleri yukarıda bölüm 4.1-4.6'da açıklandığı gibi kaldırın ve yıkayın.
  2. Antikor boyama için hücreleri, her biri 1 x 105 hücre / mL'de en az 600 μL hücre içeren buz üzerindeki mikrosantrifüj tüplerine eşit olarak bölün.
    NOT: Hemojenik EC'lerin antikor boyaması için sekiz tüp hücre gereklidir: lekesiz kontrol, CD31 tek antikor kontrolü, CD45 tek antikor kontrolü, KDR tek antikor kontrolü, c-Kit tek antikor kontrolü, CD34 tek antikor kontrolü, VE-kadherin tek antikor kontrolü ve altı antikorun tümünü içeren örnek.
    NOT: Antikor bilgileri Malzeme Tablosunda verilmiştir.
  3. Hücreleri içeren tüplere uygun şekilde antikorlar ekleyin ve buz üzerinde kuluçkaya yatırın ve 30 dakika boyunca ışıktan koruyun.
    1. Lekesiz kontrol: Antikor eklemeyin.
    2. CD31 tek antikor kontrolü: Sadece CD31 antikoru ekleyin.
    3. CD45 tek antikor kontrolü: Sadece CD45 antikoru ekleyin.
    4. KDR tek antikor kontrolü: Sadece KDR antikoru ekleyin.
    5. c-Kit tek antikor kontrolü: Sadece c-Kit antikoru ekleyin.
    6. CD34 tek antikor kontrolü: Sadece CD34 antikoru ekleyin.
    7. VE-kadherin tek antikor kontrolü: Sadece VE-kadherin antikoru ekleyin.
    8. Örnek: CD31, CD45, KDR, c-Kit, CD34 ve VE-kadherin antikorları ekleyin.
      NOT: Numunedeki nihai antikor konsantrasyonu ve floresan konjugatlar, kullanılan spesifik antikorlara ve hücre sıralayıcısına göre optimize edilmelidir.
  4. Hücreleri 4 °C'lik bir mikrosantrifüjde santrifüjleme ile 1.000 x g'da 5 dakika boyunca pelet edin.
  5. Süpernatantı çıkarın ve peletleri 600 μL buz gibi soğuk ayırma tamponunda yeniden askıya alın.
  6. Numuneleri 5 mL FACS tüplerinin ağ filtre kapağından süzün ve anında FACS için hücreleri ışıktan korunan buz üzerinde saklayın.
  7. Hemojenik endotel hücrelerini (CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Kadherin- CD45-) elde etmek için aşağıdaki adımları uygulayın.
    1. CD45 hücre popülasyonunu ve kapısını (CD45-) tanımlayın.
    2. İçinde (CD45-), CD31 + hücre popülasyonunu ve kapısını (CD31 +) tanımlayın.
    3. İçinde (CD31+), VE-Kadherin hücre popülasyonunu ve kapısını (CDH5-) tanımlayın.
    4. (CDH5-) içinde, c-Kit+ hücre popülasyonunu ve kapısını (KIT+) tanımlayın.
    5. (KIT +) içinde, CD34 + hücre popülasyonunu ve kapısını (CD34 +) tanımlayın.
    6. (CD34+) içinde, KDR+ hücrelerini tanımlayın ve 6 mL buz gibi soğuk hücre sıralama arabelleğine ayırın. Bu hücreleri aşağı akış uygulamalarında kullanın (bkz. bölüm 8).

8. Koloni oluşturan birim tahlili

  1. Metilselüloz bazlı ortamın alikotlarını üreticinin talimatlarını izleyerek çözün.
    NOT: İki numune için bir adet 3 mL aliquot ve üç numune için bir adet 4 mL aliquot yeterlidir.
  2. Adım 7.7'de elde edilen sıralanmış hemojenik endotel hücrelerini sayın.
  3. Üreticinin talimatlarını takiben, her bir metilselüloz bazlı ortam alikotuna eklenecek sıralanmış hücrelerin hacmini hesaplayın, böylece her örnek en az 1.000 hemojenik endotel hücresi içerecektir.
    NOT: Hücre sayısı gerektiği gibi ayarlanabilir.
  4. Hesaplanan hücre hacmini metilselüloz bazlı ortam aliquot ve vortekse iyice ekleyin. Metilselüloz bazlı orta kültürlerin oda sıcaklığında 10 dakika veya kabarcıklar dağılana kadar oturmasına izin verin.
  5. Fibronektin kaplama çözeltisini hazırlanan 35 mm'lik tabaklardan aspire edin. Üreticinin talimatlarını takiben, 35 mm'lik çanak başına 1 mL metilselüloz bazlı orta kültür dağıtın. Kültürü eşit olarak dağıtmak için çanağı yavaşça döndürün.
  6. Bu 35 mm'lik tabakları ve steril suyla doldurulmuş iki adet 35 mm'lik tabağı 15 cm'lik bir doku kültürü kabına yerleştirin.
  7. Kültürleri 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöründe inkübe edin ve kültürleri 8. ve 14. günlerde gözlemleyin.
    1. 8. günde, CFU-E ve BFU-E kolonilerini sayın.
    2. 14. günde, CFU-GM ve CFU-GEMM kolonilerini sayın.
      NOT: Koloni tiplerinin morfolojik olarak tanımlanması için metilselüloz bazlı ortam el kitabına bakınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

hESC'lerden ilkel EC'lerin ve hemojenik EC'lerin özelliklerini özetleyen bir şematik ve kaplamadan 24 saat sonra hücrelerin temsili bir görüntüsü Şekil 1'de gösterilmiştir. Spesifikasyona uygun olarak, ilkel EC'ler ve hemojenik EC'ler sırasıyla 5. ve 8. günlerde saflaştırılır. İlkel EC'ler CD31+ CD45- ve hemojenik EC'ler CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45- olarak tanımlanır. İlkel EC'ler ve hemojenik EC saflaştırması için temsili bir akış sitometrik geçit stratejisi Şekil 2'de gösterilmiştir. Hücreler başlangıçta saflaştırılmış ilkel ECs elde etmek için CD45'in negatif ekspresyonuna ve CD31'in pozitif ekspresyonuna dayanarak kapılıdır (Şekil 2A). Saflaştırılmış hemojenik ECs elde etmek için, hücreler başlangıçta Şekil 2A'da olduğu gibi kapılanır ve daha sonra (sırayla) VE-Cadherin (CDH5), c-Kit (KIT), CD34 ve KDR'nin (Şekil 2B) pozitif veya negatif ekspresyonuna dayanarak daha da saflaştırılır.

Farklılaşmanın 5. gününde (protokol bölüm 4) FACS ile izole edilen H9-Fucci-hES'den türetilmiş ilkel CD31 + CD45- endotel hücrelerinin endotel alt tiplerine yol açma potansiyelini değerlendirmek için, saflaştırılmış hücreler, arteriyel spesifikasyonu indüklemek için Çentik ligand DLL4 veya PBS (kontrol) ile kaplanmış plakalara ekilir ve 37 ° C'de 24 saat boyunca inkübe edilir, % 5 CO2 inkübatör. Hücreler daha sonra RNA lizis tamponu ile lize edilir, RNA ekstrakte edilir ve cDNA'ya ters transkribe edilir ve DLL4 ile tedavi edilen ve kontrol hücrelerindeki gen ekspresyon seviyelerini karşılaştırmak için qPCR gerçekleştirilir. Beklendiği gibi, DLL4 üzerinde yetiştirilen endotel hücreleri, Çentik duyarlı gen HEY2'nin yanı sıra arteriyel ilişkili genler EFNB2, GJA5 ve GJA4'ün ekspresyonunu arttırmıştır. Ek olarak, bu hücreler ayrıca venöz transkripsiyon faktörü NR2F2'nin ekspresyonunu da azaltmıştır (Şekil 3A). Alternatif olarak, DLL4 tedavisinin hücre döngüsü durumu üzerindeki etkisini belirlemek için, FACS saflaştırılmış CD31 + CD45- hücreleri, 24 saat boyunca DLL4 veya PBS ile kaplanmış plakalar üzerinde inkübe edilir, kaldırılır ve hCdt1 (30/120)-mCherry (geç G1) ve hGem (1/110)-mVenüs (S / G2 / M) ekspresyonuna göre analiz edilir. Çentik sinyallemesinin geç G1 hücre döngüsü tutuklamasını teşvik ettiği bulgularıyla tutarlıolarak, ilkel EC'lerin daha büyük bir yüzdesi, kontrol hücrelerine kıyasla, DLL4 varlığında büyümeden sonra geç G1'de tutuklanır (Şekil 3B, C).

Hemojenik endotel hücrelerinin hematopoetik potansiyelini doğrulamak için, FACS (bölüm 7'deki yöntemler) ile izole edilen CD31 + KDR + c-Kit + CD34 + VE-Kadherin- CD45- endotel hücreleri, koloni oluşturan birim (CFU) tahlillerinde hematopoetik progenitör hücrelerin büyümesi için formüle edilmiş metilselüloz bazlı bir ortamda tohumlanır ve 14 gün boyunca büyümesine izin verilir. CFU-E eritroid kolonileri ve blast-form birim (BFU)-E eritroid kolonileri 8. günde sayılır (Şekil 4A,B), CFU-GM granülosit/makrofaj ve GFU-GEMM (granülosit, eritroid, makrofaj ve megakaryosit) multipotent hematopoetik progenitör koloniler 14. günde sayılır (Şekil 4C ve D). Kaplanan 1.000 hemojenik ECs başına yaklaşık 20 CFU üretilir (Şekil 4F). Endotel hücre morfolojisine sahip hücreler kültürlerde de görülebilir (Şekil 4E); bunlar tek hücre düzeyinde çok soylu hematopoetik progenitörlere yol açan hemojenik endotel hücreleridir37.

Figure 1
Şekil 1: İlkel ve hemojenik EC'lerin spesifikasyonu için protokol . (A) Farklılaşma protokolünün şematik diyagramı. Embriyonik kök hücreler -1. günde matriks protein kaplı plakalara kaplanır ve gece boyunca yapışmasına izin verilir. Hücreler daha sonra sırasıyla ilkel çizgi ve mezoderm spesifikasyonunu indüklemek için sırasıyla GSK3i inhibitörü (CHIR99021) ve bFGF ile 0. ve 1. günlerde tedavi edilir. 2. Gün'den başlayarak, hücreler ilkel EC gelişimini teşvik etmek için BMP4 ve VEGF-A'nın bir kombinasyonu ile tedavi edilir. İlkel EC'ler (kırmızı daire), 5. Günde saflaştırılan FACS'tır. Alternatif olarak, hemojenik ECs oluşturmak için, ilkel EC'lerin üzerindeki ortam, 5. Gün'de BMP4, VEGF-A ve RA içeren taze hemojenik farklılaşma ortamına değiştirilir. Bu ortam, hemojenik EC'lerin (kırmızı yıldız) FACS'ın saflaştırıldığı 8. Güne kadar günlük olarak değiştirilir. (B) Farklılaşmanın 0. Günündeki koloniler, ölçek çubuğu = 100 μm. Panel A, Elsevier'in izniyle Qiu ve ark.37'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: hESC'lerden türetilen hemojenik EC'lerin FACS analizi. (A) ilkel EC'lerin ve (B) hemojenik EC'lerin saflaştırılması için temsili akış sitometrik geçiş stratejisi. Hemojenik EC'ler ilkel EC'lerden türetildiğinden, CD45 ve CD31 için akış sitometrisi geçiş stratejisinin her iki hücre popülasyonu için de aynı olduğunu unutmayın. Her panelin (numunenin) en üst sırasında, protokol bölüm 6'da açıklandığı gibi hemojenik EC'lere farklılaşmış ve protokol bölümü 7.3.8'de açıklandığı gibi antikorlarla boyanmış hücreler gösterilmektedir. Her panelin (kontrol) alt satırında gösterilenler, RA tedavisi olmadan 8 gün boyunca farklılaşan lekesiz hücrelerdir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: H9-Fucci CD31+ CD45- primordial endotel hücrelerinin DLL4-indüksiyonu, geç G1 arresti ve artmış arteriyel gen ekspresyonu ile sonuçlanır. (A) CD31+ CD45- H9-hESC- türevi primordial endotel hücrelerinin DLL4 tedavisi, farklılaşmanın 5. gününde saflaştırılan Fucci yapısını ekspresyonuna neden olur, arteriyel genlerin (i-iii) ve Notch duyarlı gen Hey2'nin (v) ekspresyonunun artmasına neden olur, buna venöz gen NR2F2'nin ekspresyonunda eşzamanlı bir azalma eşlik eder (iv). (B) PBS (kontrol) veya DLL4 üzerinde 24 saat boyunca yetiştirilen 5.000 H9-Fucci türevi CD31 + CD45- hücre döngüsü durumu dağılımını gösteren temsili FACS grafikleri. (C) DLL4 indüksiyonu, geç G1 fazındaki hücrelerde kontrole kıyasla% 15'lik bir artışa neden olur. Veriler, panelde (B) gösterilen aynı deneyden alınan üçlü örneklerin ortalamasıdır. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: hESC'lerden türetilen hemojenik EC'lerin hematopoetik potansiyelinin analizi. H1-hESC türevi (A) CFU-E eritroid kolonisinin (ölçek çubuğu = 35 μm), (B) BFU-E eritroid kolonisinin (ölçek çubuğu = 75 μm), (C) CFU-GM granülosit/makrofaj kolonisinin, (D) CFU-GEMM multipotent hematopoetik progenitör kolonisinin ve (E) altta yatan endotel hücreleri (ECs) (kırmızı oklar) ile CFU-GM granülosit/makrofaj kolonisinin morfolojisini gösteren temsili görüntüler. (F) 1.000 kaplama hemojenik endotel hücresi başına oluşan CFU'ların sayısı ve dağılımı. Ölçek çubuğu = 100 μm inç (C-E). Bu protokol kullanılarak farklılaştırılan CFU'ların ek görüntüleri Qiu ve ark.37'de bulunabilir. Panel F, Elsevier'in izniyle Qiu ve ark.37'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ad İletmek Ters
EFNB2 TATGCAGAACTGCGATTTCCAA TGGGTATAGTACCAGTCCTTGTC
EPHB4 CGCACCTACGAAGTGTGTGA GTCCGCATCGCTCTCATAGTA
GJA5 Serisi CCGTGGTAGGCAAGGTCTG ATCACACCGGAAATCAGCCTG
cesaret4 ACACCCACCCTGGTCTAC CACTGGCGACATAGGTGCC
HEY2 GCCCGCCCTTGTCAGTATC CCAGGGTCGGTAAGGTTTATTG
NR2F2 GGACCACATACGGATCTTCCAA ACATCAGACAGACCACAGGCAT

Tablo 1: qPCR primer bilgileri

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, murin besleyici ve serumsuz 2D kültür sistemi kullanılarak yaklaşık 1 hafta içinde insan embriyonik kök hücrelerinden hemojenik endotel hücrelerinin üretilmesi için adımlar özetlenmiştir (Şekil 1). Bu protokol, ilkel ECs38'i elde etmek için Sriram et al. (2015) tarafından açıklanan bir yöntem üzerinde genişlemektedir. CD31 + CD45- ECs'nin ilkel doğası ve spesifikasyon potansiyeli, bu hücrelerin DLL4 kaplı plakalarda kültürlenmesi ve arteriyel spesifikasyonla tutarlı gen ekspresyon değişikliklerinin gözlemlenmesiyle gösterilmiştir (Şekil 3). Ek olarak, arteriyel kimliğin kazanılması, önceki çalışmalarla tutarlı olan geç G1 hücre döngüsü durması ile ilişkilidir (Şekil 3)27. 0.5 μM RA, 25 ng/mL BMP4 ve 50 ng/mL VEGF-A varlığında ilkel EC'leri 3 gün daha kültüre aldıktan sonra, CFU-eritroid, BFU-eritroid, CFU-granülosit/makrofaj ve CFU-granülosit, eritrosit, makrofaj ve megakaryosit kolonilerine yol açabilen FACS-izolatlı hemojenik EC'ler üretmek ve FACS-izole etmek mümkün olmuştur (Şekil 4 ). Yakın zamanda yayınlanan bir çalışmada bu yöntem kullanılarak, pluripotens kaybı, ilkel çizgi ve mezoderm indüksiyonu, endotel hücre kimliğinin kazanılması ve son olarak hematopoetik kimlik ile tutarlı 8 günlük bir zaman diliminde gen ekspresyon değişiklikleri gözlenmiştir37. Ayrıca, RA tedavisi, hemojenik EC spesifikasyonunu etkinleştirmek için erken G1 hücre döngüsü durmasına neden olmuştur37.

Son zamanlarda, Ohta ve ark. (2019), hemojenik EC'lerin hPSC'lerden39'dan farklılaşması için bir protokol tanımlamıştır. Bununla birlikte, yukarıda açıklanan protokol önemli avantajlar sunar: 1) bu yöntem sferoidlerin oluşumunu gerektirmez; 2) Bu protokol, hipoksik bir inkübatör yerine standart bir 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü kullanır ve özel özel ekipmana olan ihtiyacı ortadan kaldırır; ve 3) bu protokol sadece bir ortam (PFHM ile desteklenmiş pluripotent kök hücre farklılaşma ortamı), maliyet tasarrufu avantajı sağlarken, Ohta protokolü indüksiyon için iki ortam gerektirir. Galat ve ark. (2017) tarafından yakın zamanda yayınlanan bir başka çalışmada, CD34 + hemojenik endotel hücrelerinin 40 popülasyonunu oluşturmak için CHIR99021 indüksiyonunun kullanıldığı bir protokol tanımlanmıştır. Bu hücreler ayrıca CD31'i eksprese ettiler ve tek katmanlı koşullar altında kültürlendiğinde endotel hücrelerine veya ek sitokinlerin varlığında sırasıyla OP9 veya OP9-DLL4 hücreleri ile birlikte kültürlendikten sonra miyeloid ve lenfoid belirteçleri eksprese eden hücrelere yol açabildiler. Ek ko-kültür gereksinimi, istenen hücre popülasyonlarının murin hücreleri ile potansiyel kontaminasyonuna yol açabilir. Ek olarak, Ohta ve ark. ve Galat ve ark. burada tarif edilenden daha kısa bir hemojenik indüksiyon periyodu kullanmış olsalar da (sırasıyla 4 gün ve 5 gün, 8 gün), her ikisi de hemojenik EC'leri CD34 + olarak tanımlarken, bu protokol daha katı bir tanım kullanmıştır: CD31 + KDR + c-Kit + CD34 + VE-Cadherin- CD45- . CD34, hematopoetik hücrelerin bir belirteci olarak kabul edilirken, mezenkimal stromal hücreler ve endotel hücreleri41 gibi diğer hematopoetik olmayan hücre tipleri tarafından da eksprese edilir. Bu protokoldeki hemojenik EC'lerin tanımı (CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Kadherin- CD45-) bu nedenle daha titizdir ve daha tanımlanmış bir popülasyonu temsil eder.

Terapötik uygulamalarda hESC'lerin veya hiPSC'lerin kullanımının bir sınırlaması, gerekli olan çok sayıda hücredir ve standart 2D türetme yöntemleri öncelikle küçük ölçekli farklılaşmalarla sınırlıdır. HiPSC hatlarını kullanarak, Olmer ve ark. (2018), süspansiyon kültürü veya karıştırılmış tank biyoreaktörü6 kullanarak hem arteriyel (DLL4) hem de venöz (EPHB4) hücre belirteçlerini ifade eden fonksiyonel CD31 + EC'lerin üretimini artırmanın fizibilitesini göstermiştir. Daha da önemlisi, CD34 ve KDR'yi 20 mL süspansiyon kültürü içeren tek bir şişeden birlikte eksprese eden 1.18 x 107 CD31 + ECs elde edebildiklerini gösterdiler. Terapötik uygulamaların çoğunluğu için gerekli olan 3 x 108 EC'yi elde etmek için, iki adet 500 mL'den biraz daha fazla şişe gerekli olacaktır6. Gelecekteki deneyler, hemojenik EC'lerin büyük ölçekli üretimi için burada sunulan protokole ölçekleme tekniklerinin uygulanmasını araştırmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarın açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgments

Bu çalışma kısmen NIH hibeleri HL128064 ve U2EB017103 tarafından desteklenmiştir. CT Innovations 15-RMB-YALE-04 hibesi ile daha fazla destek sağlanmıştır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 cm dishes Corning 430599 tissue culture treated
35 mm dishes Corning 430165 tissue culture treated
6-well plates Corning 3516 tissue culture treated
Antimicrobial reagent
Brand Name: Normocin		 Invitrogen ant-nr-1
bFGF R&D systems 233-FB-025 use at 50 ng/mL
BMP4 BioLegend 595202 use at 25 ng/mL
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-1
Cell Detatchment Solution
Brand Name: Accutase		 Stemcell Technologies 7920
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2650-100mL
Dispase Stemcell Technologies 7913
DLL4 R&D systems 1506-D4/CF recombinant human; use at 10 μg/mL
DMEM:F12 Gibco 11320-033
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190144
Endothelial cell growth medium
Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)		 Lonza CC-3162
FACS tubes Corning 352235 polystyrene round bottom with filter cap
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio 100-106
Fibronectin ThermoFisher Scientific 33016015 use at 4 μg/cm2
GSK3i/CHIR99021 Stemgent 04-0004-02 10 mM stock; use at 5 μM
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 14175-095
Hydrochloric Acid (HCl) Fisher Scientific A144S-500
Matrix protein 
Brand Name: Matrigel		 Corning 356230 Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein.
Methylcellulose-based medium
Brand Name: MethoCult H4435 Enriched		 Stemcell Technologies 4435
Pluripotent stem cell differentiation medium
Brand Name: STEMdiff APEL 2		 Stemcell Technologies 5270
Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI WiCell WA09 (H9), WA01 (H1) human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier's lab at Cambridge Stem Cell Institute
Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH) Gibco 12040077
Retinoic Acid Sigma Aldrich R2625-50mg use at 0.5 μM
Reverse transcription master mix
Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix		 BioRad 1708840
RNA extraction kit
Brand Name: RNeasy Mini Kit		 Qiagen 74104
Sodium Hydroxide (NaOH) Fisher Scientific SS255-1
Stem cell growth medium
Brand Name: mTeSR1		 Stemcell Technologies 85850
SYBR Green master mix
Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix		 BioRad 1725121
Trypsin-EDTA Gibco 25299956 0.25%
VEGF165 (VEGF-A) PeproTech 100-20 use at 50 ng/mL
α-CD31-FITC BioLegend 303104 2 μg/mL*
α-CD34-Pacific Blue BioLegend 343512 2 μg/mL*
α-CD45-APC/Cy7 BioLegend 304014 2 μg/mL*
α-c-Kit-APC BioLegend 313206 2 μg/mL*
α-Flk-1-PE/Cy7 BioLegend 359911 2 μg/mL*
α-VE-Cadherin-PE BioLegend 348506 2 μg/mL*
* Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
  2. Wu, J., Wu, Z., Xue, Z., Li, H., Liu, J. PHBV/bioglass composite scaffolds with co-cultures of endothelial cells and bone marrow stromal cells improve vascularization and osteogenesis for bone tissue engineering. RSC Advances. 7 (36), 22197-22207 (2017).
  3. Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Microvasculature: An essential component for organ-on-chip systems. MRS Bulletin. 39 (1), 51-59 (2014).
  4. Gritz, E., Hirschi, K. K. Specification and function of hemogenic endothelium during embryogenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (8), 1547-1567 (2016).
  5. Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells: Methods, considerations, and applications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
  6. Olmer, R., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional endothelial cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 10 (5), 1657-1672 (2018).
  7. Cossu, G., et al. Lancet Commission: Stem cells and regenerative medicine. The Lancet. 391 (10123), 883-910 (2018).
  8. Fox, I. J., et al. Use of differentiated pluripotent stem cells in replacement therapy for treating disease. Science. 345 (6199), 1247391 (2014).
  9. Mahla, R. S. Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics. International Journal of Cell Biology. 2016, 1-24 (2016).
  10. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  11. Rowe, R. G., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).
  12. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
  13. Wnorowski, A., Yang, H., Wu, J. C. Progress, obstacles, and limitations in the use of stem cells in organ-on-a-chip models. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 3-11 (2019).
  14. Ramme, A. P., et al. Autologous induced pluripotent stem cell-derived four-organ-chip. Future Science OA. 5 (8), 1-12 (2019).
  15. Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
  16. Kane, N. M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells by directed differentiation: analysis of microrna and angiogenesis in vitro and in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (7), 1389-1397 (2010).
  17. Costa, M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells in fully defined medium enables identification of lysophosphatidic acid and platelet activating factor as regulators of eNOS localization. Stem Cell Research. 10 (1), 103-117 (2013).
  18. Nguyen, M. T. X., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to endothelial progenitor cells on laminins in defined and xeno-free systems. Stem Cell Reports. 7 (4), 802-816 (2016).
  19. Ikuno, T., et al. Efficient and robust differentiation of endothelial cells from human induced pluripotent stem cells via lineage control with VEGF and cyclic AMP. PLOS One. 12 (3), 0173271 (2017).
  20. Aoki, H., et al. Efficient differentiation and purification of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells and expansion with the use of inhibitors of ROCK, TGF-B, and GSK3B. Heliyon. 6 (3), 03493 (2020).
  21. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of Wnt signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
  22. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  23. Kusuma, S., Gerecht, S. Derivation of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells. Human Embryonic Stem Cell Protocols. Turksen, K. , Humana Press. New York, NY. 213-222 (2014).
  24. Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via wnt activation under defined conditions. Methods in Molecular Biology. 1481, 183-196 (2016).
  25. Xu, M., He, J., Zhang, C., Xu, J., Wang, Y. Strategies for derivation of endothelial lineages from human stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 200 (2019).
  26. Arora, S., Yim, E. K. F., Toh, Y. -C. Environmental specification of pluripotent stem cell derived endothelial cells toward arterial and venous subtypes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 143 (2019).
  27. Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communications. 8 (1), 2149 (2017).
  28. Dalton, S. Linking the cell cycle to cell fate decisions. Trends in Cell Biology. 25 (10), 592-600 (2015).
  29. Wolf, K., Hu, H., Isaji, T., Dardik, A. Molecular identity of arteries, veins, and lymphatics. Journal of Vascular Surgery. 69 (1), 253-262 (2019).
  30. Rocha, S. F., Adams, R. H. Molecular differentiation and specialization of vascular beds. Angiogenesis. 12 (2), 139-147 (2009).
  31. Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis. Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).
  32. Chanda, B., Ditadi, A., Iscove, N. N., Keller, G. Retinoic acid signaling is essential for embryonic hematopoietic stem cell development. Cell. 155 (1), 215-227 (2013).
  33. Marcelo, K. L., et al. Hemogenic endothelial cell specification requires c-kit, notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control. Developmental Cell. 27 (5), 504-515 (2013).
  34. Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. The molecular basis of endothelial cell plasticity. Nature Communications. 8 (1), 14361 (2017).
  35. Ottersbach, K. Endothelial-to-haematopoietic transition: an update on the process of making blood. Biochemical Society Transactions. 47 (2), 591-601 (2019).
  36. Pauklin, S., Vallier, L. The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity. Cell. 155 (1), 135-147 (2013).
  37. Qiu, J., Nordling, S., Vasavada, H. H., Butcher, E. C., Hirschi, K. K. Retinoic acid promotes endothelial cell cycle early g1 state to enable human hemogenic endothelial cell specification. Cell Reports. 33 (9), 108465 (2020).
  38. Sriram, G., Tan, J. Y., Islam, I., Rufaihah, A. J., Cao, T. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to arterial and venous endothelial cells under feeder- and serum-free conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 261 (2015).
  39. Ohta, R., Sugimura, R., Niwa, A., Saito, M. K. Hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59823 (2019).
  40. Galat, Y., et al. Cytokine-free directed differentiation of human pluripotent stem cells efficiently produces hemogenic endothelium with lymphoid potential. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 67 (2017).
  41. Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: Evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), Dayton, Ohio. 1380-1389 (2014).

Tags

Gelişim Biyolojisi Sayı 169 pluripotent insan kök hücreleri insan endotel hücreleri hemojenik endotel hücreleri arteriyel endotel hücreleri hücre kültürü protokolü yönlendirilmiş farklılaşma
Hemojenik Endotel Hücrelerinin İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Yönlendirilmiş Farklılaşması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nelson, E. A., Qiu, J., Chavkin, N.… More

Nelson, E. A., Qiu, J., Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (169), e62391, doi:10.3791/62391 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter