Summary
Præsenteret her er en simpel protokol til rettet differentiering af hæmogene endotelceller fra humane pluripotente stamceller i ca. 1 uge.
Abstract
Blodkar er allestedsnærværende fordelt i alle væv i kroppen og udfører forskellige funktioner. Således er afledning af modne vaskulære endotelceller, der linjer blodkar lumen, fra humane pluripotente stamceller afgørende for en lang række vævsteknik og regenereringsapplikationer. In vivo er primordiale endotelceller afledt af den mesodermale afstamning og er specificeret mod specifikke undertyper, herunder arterielle, venøse, kapillæriske, hæmogene og lymfatiske. Hæmogene endotelceller er af særlig interesse, fordi de under udviklingen giver anledning til hæmatopoietiske stam- og stamceller, som derefter genererer alle blodlinjer gennem hele livet. Oprettelse af et system til generering af hæmogene endotelceller in vitro ville således give mulighed for at studere endotel-til-hæmatopoietisk overgang og kan føre til ex vivo-produktion af humane blodprodukter og reduceret afhængighed af humane donorer. Mens der findes flere protokoller til afledning af stamceller og primordiale endotelceller, er generering af velkarakteriserede hæmogene endotelceller fra humane stamceller ikke blevet beskrevet. Her præsenteres en metode til afledning af hæmogene endotelceller fra humane embryonale stamceller på ca. 1 uge: en differentieringsprotokol med primitive streakceller dannet som reaktion på GSK3β-hæmmer (CHIR99021), derefter mesoderm-afstamningsinduktion medieret af bFGF, efterfulgt af primordial endotelcelleudvikling fremmet af BMP4 og VEGF-A og endelig hæmogen endotelcellespecifikation induceret af retinsyre. Denne protokol giver en veldefineret population af hæmogene endotelceller, der kan bruges til yderligere at forstå deres molekylære regulering og endotel-til-hæmatopoietisk overgang, som har potentialet til at blive anvendt til downstream terapeutiske anvendelser.
Introduction
Endotelceller (EC'er) er en heterogen population af celler, der udfører flere funktioner i hele menneskekroppen og i manipulerede væv. Ud over at understøtte og regulere andre celletyper (dvs. kardiomyocytter1, osteoblastiske celler2) omfatter disse funktioner dannelse af en selektiv barriere mellem blod og væv og hjælp til vævsdannelse3. Differentiering af modne EC'er under normal udvikling kræver forskellige signalveje. Primordial EC'er er afledt af mesoderm forfædre og specificeres derefter mod modne arterielle, venøse, kapillære og lymfatiske fænotyper4. Derudover er en lille delmængde af EC'er i den ekstraembryonale æggeblomme sac og embryonale Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) region også specificeret til at blive hæmogene EC'er, som giver anledning til hæmatopoietiske stam- og stamceller (HSPC'er), der migrerer til fosterleveren og føtal knoglemarv, hvor de forbliver postnatalt og genererer alle blodcelletyper gennem hele livet4. Den mangfoldige vifte af EF-fænotyper er afgørende for al vævsudvikling og vedligeholdelse.
EC'er og deres derivater er således kritiske komponenter i undersøgelser, der sigter mod modellering og belysning af mekanismer for menneskelig udvikling og / eller sygdom samt regenerativ medicin og vævstekniske applikationer 5,6,7,8. Den største begrænsning for denne type undersøgelser er imidlertid manglen på tilgængelighed af primære humane EC'er i den krævede mængde. Det anslås, at der vil være behov for mindst 3 x 108 EC'er til de fleste terapeutiske anvendelser6. For at løse dette problem er brugen af humane embryonale stamceller (hESC'er) og humaninducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er) blevet foreslået på grund af deres forskellige afstamningspotentiale og deres evne til at generere et stort antal afkom 6,9.
Faktisk er anvendeligheden af celler afledt af hESC'er eller hiPSC'er blevet demonstreret i flere undersøgelser med fokus på sygdomsmodellering og lægemiddelscreening10,11,12. Organ-on-a-Chip (OOC) teknologi er blevet brugt til mere trofast at rekapitulere fysiologien i den menneskelige krop ved at integrere celler og væv i tredimensionelle stilladser. Desuden kan tilslutning af flere individuelle OOC'er (en såkaldt body- eller human-on-a-chip, BOC/HOC) opnås via mikrofluidik for at muliggøre krydstale mellem organerneaf interesse 13,14,15. Understøttende væv, såsom vaskulaturen, er kritiske komponenter i OOC'er og BOC / HOC'er; Inkorporering af vaskulatur muliggør transport af næringsstoffer, ilt og parakrine faktorer gennem vævene og derved fremmer det nødvendige vævsspecifikke mikromiljø 3,12. Således er metoder til udledning af modne humane EC'er, såsom arterielle, venøse, lymfatiske og hæmogene EC'er, afgørende for at fremme disse vævstekniske tilgange.
Der er offentliggjort flere protokoller, der beskriver trin til afledning af menneskelige ur- eller stamfader-EC'er fra hESC'er eller hiPSC'er 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Mange af disse protokoller er afhængige af embryoid body (EB) dannelse eller co-kultur af ESC'er / iPSC'er med et murinføderlag af stromale celler. Disse strategier har tendens til at være vanskelige og tidskrævende med lave EF-udbytter og / eller forurening af humane EC'er med murinceller. Protokoller, der udelukkende er afhængige af 2D-kultur uden brug af stromale celler, kræver ofte lange induktioner, anvender komplekse kombinationer af vækstfaktorer og / eller hæmmere til induktion, har længere ekspansionsperioder efter celleseparation eller en kombination af disse faktorer. Øget viden om signalveje og faktorer, der er involveret i afledning af modne EF-typer in vivo, danner grundlaget for en enkel og robust in vitro-differentieringsprotokol.
Tidligere blev nøgleroller for Notch og Retinoic Acid (RA) signalveje i specifikationen af henholdsvis murine arterielle og hæmogene EC'er under udvikling identificeret. Notch-signalvejen spiller flere roller i specifikationen og vedligeholdelsen af den arterielle EC-fænotype. Arbejde ved hjælp af murine retinal vaskulariseringsmodel identificerede en vej, hvor væskeforskydningsspænding inducerer en Notch-Cx37-p27 signalakse, der fremmer G1-cellecyklusstop, hvilket muliggør arteriel EC-specifikation27. Cellecyklustilstande er blevet antaget at spille en rolle i celleskæbnebeslutninger ved at give forskellige muligheder, hvor celler er modtagelige for visse signaler, der kan inducere genekspression og fænotypiske ændringer28. Denne Notch-medierede G1-anholdelse muliggjorde ekspression af gener beriget i arterielle EC'er, herunder ephrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 og Notch 4 (gennemgået i29,30). Det har også vist sig, at hæmogen EF-specifikation fremmes in vivo via RA-signalering31,32. Yderligere undersøgelser identificerede, at nedstrøms for RA-signalering, ekspression af c-Kit og Notch opregulerer p27, hvilket muliggør hæmogen specifikation i murine æggeblommesækken og AGM33. Murine hæmogene EC'er kan minimalt identificeres ved ekspression af både endotel (dvs. CD31, KDR) og hæmatopoietiske (dvs. c-Kit, CD34) markører4. Endelig gennemgår hæmogene EC'er en endotel-til-hæmatopoietisk overgang (EHT) til dannelse af HSPC'er, som kan give anledning til alle blodcelletyper 4,34,35.
Nyligt arbejde testede, om det samme signalhierarki kan fremme menneskelig hæmogen EF-specifikation. For at gøre dette blev der udviklet en serum- og feederfri 2D-kulturprotokol til at udlede hæmogene EC'er fra hESC'er, og disse hæmogene EC'er blev karakteriseret på et enkelt celleniveau som CD31 + KDR + c-Kit + CD34 + VE-Cadherin- CD45-. Denne undersøgelse udnyttede også FUCCI-reporteren (Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator), som identificerer forskellige cellecyklustilstande ved hjælp af H9-hESC'er, der udtrykker FUCCI-reporterkonstruktionen (H9-FUCCI-hESC)36. I undersøgelser med disse celler blev det påvist, at RA fremmer tidlig G1-cellecyklusstop i EC'er, og tidlig G1-tilstand muliggør hæmogen specifikation in vitro37. Heri gives en detaljeret protokol til differentiering af disse humane hæmogene endotelceller og assays, der bekræfter deres identitet. Denne enkle metode giver et nyttigt middel til at generere denne specialiserede delmængde af EC'er til fremtidige undersøgelser af mekanismer for udvikling af humane blodlegemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af reagenser og reagens
BEMÆRK: En liste over reagenser findes i Materialefortegnelse.
- Få de humane pluripotente stamcellelinjer: H1-hESC, H9-Fucci-hESC.
BEMÆRK: Genereringen af hæmogene EC'er kan være mere effektiv i H1-cellelinjen. - Forbered matrixproteinlagre: Aliquot matrixproteinet i forkølede 1,5 ml rør (på is), så hvert rør indeholder 1 mg matrixprotein. 1 mg matrixprotein er nok til at belægge alle brønde af to 6-brøndsplader (12 brønde i alt). Alikvoterne opbevares ved -20 °C indtil brug.
BEMÆRK: Udfør alle trin, der involverer matrixprotein på is eller ved 4 °C. Optø det frosne hætteglas med matrixprotein på is ved 4 °C natten over. Når det er optøet, hvirvles hætteglasset for at sikre, at indholdet blandes. Prechill 1,5 ml mikrocentrifugerør i mindst 1 time ved -20 °C og overføres til is umiddelbart før aliquoting. - Matrixproteinovertrukne plader: Optøningsmatrixproteinalikvoter på is ved 4 °C. Tilsæt 12,5 ml iskold DMEM: F12 til et forkølet konisk rør på is. Ved hjælp af forkølede pipettespidser overføres en aliquot (1 mg) matrixprotein til det koniske rør og blandes godt ved at pipettere op og ned. Aliquot 1 ml af det fortyndede matrixprotein til hver brønd af forkølede 6-brøndsplader (på is) ved hjælp af en forkølet serologisk pipette. Hvirvl og rock pladerne, så hele brønden er belagt jævnt. Inkuber pladerne i mindst 30 minutter ved stuetemperatur for at lade matrixproteinet størkne. Pladerne pakkes ind med parafilm og opbevares ved 4 °C indtil brug. Brug matrixproteinovertrukne plader inden for 2 uger efter tilberedning.
BEMÆRK: Brug de matrixproteinbelagte 6-brøndsplader til rutinemæssig passaging af celler og differentiering til primordiale og hæmogene endotelceller. Udfør alle trin på is. Forkøling af 6-brøndsplader, pipettespidser, serologiske pipetter og koniske rør inden brug i mindst 1 time ved -20 °C. Overfør disse genstande til is, når de er klar til brug. - Forbered basisdifferentieringsmediet ved at tilføje 5 ml PFHM til 100 ml pluripotent stamcelledifferentieringsmedium. Opbevares ved 4 °C.
- Der fremstilles 0,1 % BSA-PBS ved at opløse 0,1 g BSA i 100 ml PBS. Filtrer BSA-PBS ved at passere gennem et 0,22 μm filter og opbevares ved 4 °C.
- Der fremstilles 5 mM HCI ved at fortynde HCI-bestanden (12 M) 1:2.400 med vand. Juster pH til 3,0 ved hjælp af NaOH. Filtersteriliser opløsningen ved at føre gennem et filter på 0,22 μm og opbevares ved 4 °C.
- Forbered bFGF-, BMP4-, VEGF-A-, Retinoic Acid (RA) og DLL4-lagre.
- bFGF: Rekonstituer det frysetørrede pulver til 100 μg/ml i 0,1% BSA-PBS. Aliquot og opbevares ved -20 °C. Brug bFGF-lagre inden for 3 måneder efter forberedelsen. Optø aliquoterne umiddelbart før brug.
- BMP4: Rekonstituer det frysetørrede pulver til 1 mg / ml i 5mM HCI, pH 3,0. Yderligere fortyndes til 50 μg/ml i 0,1% BSA-PBS. Aliquot og opbevares ved -20 °C. Brug BMP4-lagrene inden for 3 måneder efter forberedelsen. Optø aliquoterne umiddelbart før brug.
- VEGF-A: Rekonstituere det frysetørrede pulver til 1 mg/ml i dH2O. Yderligere fortyndes til 100 μg/ml i 0,1% BSA-PBS. Aliquot og opbevares ved -20 °C. Brug VEGF-A-lagrene inden for 3 måneder efter tilberedningen. Optø aliquoterne umiddelbart før brug.
- RA: Rekonstituer det frysetørrede pulver til 100 mM i DMSO. Aliquot og opbevares ved -80 °C. Brug RA-lagrene inden for 1 måned efter forberedelsen. Optø aliquoterne umiddelbart før brug.
BEMÆRK: Beskyt RA-aktier mod lys. - DLL4: Rekonstituere det frysetørrede pulver til 1 mg/ml i PBS. Aliquot og opbevares ved -20 °C. Brug DLL4-lagrene inden for 12 måneder efter forberedelsen. Optø aliquoterne umiddelbart før brug.
- Endotelcelledifferentieringsmediet fremstilles umiddelbart før brug ved at fortynde VEGF-A og BMP4 i basedifferentieringsmedium (trin 1.4), således at de endelige koncentrationer er henholdsvis 25 ng/ml og 50 ng/ml.
- Umiddelbart før brug klargøres den fungerende leddegigt ved at fortynde 100 mM lager 1:1.000 i DMSO til 100 μM.
BEMÆRK: Beskyt arbejdende RA mod lys. - Det hæmogene endotelcelledifferentieringsmedium fremstilles umiddelbart før brug ved fortynding af VEGF-A, BMP4 og bearbejdning af RA i basedifferentieringsmedium (trin 1.4), således at de endelige koncentrationer er henholdsvis 25 ng/ml, 50 ng/ml og 0,5 μM.
- Forbered antistoffarvningsbufferen ved at fremstille HBSS indeholdende 10% FBS og suppler med 1:500 fortyndet antimikrobielt reagens. Sterilt filtrer bufferen og brug straks.
- Forbered cellesorteringsbufferen ved at fremstille HBSS indeholdende 1% FBS og suppler med 1:500 fortyndet antimikrobielt reagens. Sterilt filtrer bufferen og brug straks.
- Forbered 1 mg / ml fibronectin lagre ved at tilføje 5 ml sterilt vand til 5 mg frysetørret fibronectin. Aliquot og opbevares ved -20 °C. Brug fibronectinlagrene inden udløbsdatoen på den frysetørrede produktetiket. Optø aliquoterne umiddelbart før brug.
- Forbered de fibronectinbelagte 35 mm retter. Fortynd fibronectinlagrene (1 mg/ml) til 4 μg/ml i sterilt vand. Tilsæt 1 ml af denne fibronectinbelægningsopløsning til hver skål og inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter til 1 time. Brug opvasken umiddelbart efter belægningen.
- Der fremstilles 3 eller 4 ml alikvoter af methylcellulosebaseret medium efter producentens anvisninger. Alikvoterne opbevares ved -20 °C indtil brug. Brug methylcellulosebaserede mediealikvoter inden den udløbsdato, der er angivet på lagerproduktets etiket. Optø aliquoterne umiddelbart før brug.
- DLL4-overfladebehandlingsopløsningen fremstilles ved at fortynde rekombinant humant DLL4-materiale til en slutkoncentration på 10 μg/ml i PBS.
- Forbered og opbevar endotelcellevækstmediet i henhold til producentens anvisninger.
- Forbered flowcytometrianalysebufferen ved at fremstille PBS indeholdende 0,1% BSA. Sterilt filtrer bufferen og opbevares ved 4 °C indtil brug.
2. Cellekultur og passaging af hESC'er
- Lad matrixproteinbelagte plader, stamcellevækstmedium og DMEM: F12 varme op til stuetemperatur.
- HESC-cellelinjerne i stamcellevækstmediet (2 ml/brønd) vokser på matrixproteinbelagte 6-brøndsplader i en 37 °C, 5 % CO2 inkubator.
- Kontroller cellerne dagligt, og fjern de differentierede celler efter behov ved forsigtigt at skrabe dem af pladen ved hjælp af en p200-pipettespids.
BEMÆRK: Differentierede celler vises i periferien af kolonier. Se stamcellevækstmediets produktmanual for eksempler på differentierede celler i kultur. - Passage cellerne, når de når 70% -80% sammenløb. Udfør følgende trin for at passere celler.
BEMÆRK: Celler skal opdeles, inden de når 70% -80% sammenløb, hvis der opstår øget differentiering.- Fjern mediet over cellerne og vask forsigtigt med 1 ml DMEM: F12 pr. Brønd.
- Tilføj 1 ml DMEM: F12 pr. Brønd.
- Tilsæt 160 μL/ml Dispase pr. boring og inkuber cellerne ved 37 °C i en 5% CO2 inkubator i 45 min.
- Efter Dispase-inkubation tilsættes yderligere 1 ml DMEM:F12 pr. brønd og pipetteres forsigtigt for at løfte cellerne.
BEMÆRK: Undgå at adskille cellerne i en enkeltcellesuspension. Passage cellerne som små klumper. - Overfør cellerne til et konisk rør indeholdende 12 ml DMEM: F12 og lad cellerne sætte sig efter tyngdekraften (~ 5-10 min).
- Fjern supernatanten, og suspender forsigtigt pelleten i 0,5 ml stamcellevækstmedium pr. brønd af løftede celler for at opnå små klumper af celler.
BEMÆRK: Undgå at adskille cellerne i en enkeltcellesuspension. Passage cellerne som små klumper. - Matrixproteinbelægningsopløsningen aspireres fra brøndene i den tilberedte matrixproteinbelagte plade, og der tilsættes 1,5 ml stamcellevækstmedium pr. Brønd.
- Det ønskede volumen af resuspenderede celler (trin 2.4.6) tilsættes til hver brønd i den fremstillede matrixproteinbelagte plade.
- Pladen inkuberes i en 37 °C, 5% CO2 inkubator. Skift mediet hver 24. time til frisk stamcellevækstmedium.
3. Differentiering af hESC'er til primordiale endotelceller
- Dag -1: Dyrkning og passage af cellerne som beskrevet ovenfor i afsnit 2. Cellerne (trin 2.4.6) sås i små klumper (~50 μm) med en massefylde på ca. 2 klumper pr. kvadratcentimeter38.
BEMÆRK: Evaluer frøtætheden og forfin empirisk, hvis det er nødvendigt. - Dag 0: 24 timer efter såning af cellerne, aspirer mediet fra hver brønd og vask forsigtigt cellerne med 1 ml DMEM: F12 pr. Brønd. Der tilsættes 1 ml basisdifferentieringsmedium indeholdende 5 μM GSK3i (CHIR99021, tilsat frisk) til hvert hul, og der inkuberes i 24 timer (37 °C, 5 % CO2).
BEMÆRK: For alle vasketrin skal du langsomt tilføje det angivne vaskemedie til pladen ved at pipettere mod pladens væg godt. Hvirvl forsigtigt pladen, så hele overfladen af brønden er dækket af vaskemedier. Vip pladen let, så vaskemediet samler sig klokken seks, og opsug forsigtigt vaskemediet. - Dag 1: Aspirer mediet fra hver brønd og vask forsigtigt cellerne med 1 ml DMEM: F12 pr. Brønd. Der tilsættes 1 ml basisdifferentieringsmedium indeholdende 50 ng/ml bFGF (tilsat frisk, 1:2.000 fra frossen stamme) til hver brønd og inkuberes 24 timer (37 °C, 5 % CO2).
- Dag 2: Aspirer mediet fra hver brønd og vask forsigtigt cellerne med 1 ml DMEM: F12 pr. Brønd. Der tilsættes 1 ml endotelcelledifferentieringsmedium til hver brønd, og der inkuberes 24 timer (37 °C, 5 % CO2).
- Dag 3: Mediet over cellerne udskiftes med 1 ml frisklavet endotelcelledifferentieringsmedium pr. boring og inkuberes 24 timer (37 °C, 5 % CO2).
- Dag 4: Mediet over cellerne udskiftes med 1 ml frisklavet endotelcelledifferentieringsmedium pr. boring, og der inkuberes 24 timer (37 °C, 5 % CO2).
- Dag 5: FACS renser cellerne for at vurdere EC-fænotype (afsnit 4-5) eller holde sig i kultur og differentiere mod hæmogene endotelceller (afsnit 6).
4. FACS-oprensning af primordiale endotelceller
- Aspirer mediet over cellerne og vask forsigtigt en gang med 1 ml DMEM: F12 pr. Brønd.
- Tilsæt 1 ml celleløsningsopløsning pr. brønd, og inkuber cellerne i 12 minutter i en 37 °C, 5% CO2 -inkubator, eller indtil cellerne er dissocieret.
- De dissocierede celler overføres til et konisk rør indeholdende 12 ml DMEM:F12 og pellet ved centrifugering i 5 min., 1.000 x g.
- Supernatanten fjernes, og pelleten genoptages i 12 ml DMEM:F12 for at vaske.
- Pellet cellerne ved centrifugering i 5 min, 1.000 x g.
- Fjern supernatanten, og suspender cellepelleten i iskold antistoffarvningsbuffer og tæl cellerne. Koncentrer koncentrationen ved hjælp af iskold antistoffarvningsbuffer til 1 x 105 celler/ml.
- Cellerne fordeles jævnt i mikrocentrifugerør på is, der hver indeholder mindst 600 μL celler ved 1 x 105 celler/ml, til antistoffarvning.
BEMÆRK: Fire rør af celler er nødvendige til farvning af primordiale EC'er: ufarvet kontrol, CD31 enkelt antistofkontrol, CD45 enkeltantistofkontrol og prøve indeholdende både CD31 og CD45 antistoffer. Oplysninger om antistoffer findes i Materialefortegnelsen. - Tilsæt antistoffer til rørene, der indeholder celler, alt efter hvad der er relevant, og inkuber på is og beskyttet mod lys i 30 minutter.
- Ufarvet kontrol: Tilsæt ikke antistof.
- CD31 enkelt antistofkontrol: Tilføj kun CD31-antistof.
- CD45 enkelt antistofkontrol: Tilføj kun CD45-antistof.
- Prøve: Tilføj både CD31- og CD45-antistoffer.
BEMÆRK: Den endelige antistofkoncentration i prøven samt de fluorescerende konjugater bør optimeres baseret på de specifikke antistoffer og cellesorter, der anvendes.
- Pellets cellerne ved centrifugering i en 4 °C bordplademikrocentrifuge i 5 minutter ved 1.000 x g.
- Supernatanten fjernes, og cellepillerne gensuspenderes i 600 μL iskold sorteringsbuffer.
- Si prøverne gennem maskefilterhætterne på 5 ml FACS-rør, og opbevar cellerne på is, beskyttet mod lys, til øjeblikkelig FACS.
- Få primordiale endotelceller (CD31+ CD45-) ved at udføre følgende trin.
- Identificer den CD45-negative cellepopulation og port (CD45-).
- Inden for (CD45-) identificeres den CD31-positive (CD31+) cellepopulation og sorteres celler i 6 ml iskolde cellesorteringsbuffer. Brug disse celler til downstream-applikationer (se punkt 5).
5. Assay for at bekræfte primordial endotelcellefænotype
- Overtræk tre brønde af en 6-brønds plade med 1 ml / brønd DLL4 belægningsopløsning i 30 min i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Som en kontrol skal du mock-coate de tre andre brønde på pladen med 1 ml / brønd PBS.
- DLL4-belægningsopløsningen og PBS aspireres og plade 25.000 sorterede primordiale endotelceller (se trin 4.12) i 2 ml endotelcellevækstmedium pr. brønd.
- Cellerne inkuberes i 24 timer i en 37 °C, 5% CO2 inkubator.
- Aspirer mediet over cellerne og vask en gang med 2 ml / brønd PBS. Analyser cellerne ved qPCR eller flowcytometri (for celler, der udtrykker FUCCI-konstruktionen).
- Udfør følgende trin for at analysere cellerne med qPCR.
- Aspirer væsken over cellerne og isoler RNA'et i cellerne ved hjælp af et RNA-ekstraktionssæt i henhold til producentens protokol.
- Udfør omvendte transkriptionsreaktioner med en omvendt transkriptionsmasterblanding i henhold til producentens protokol.
- Udfør qPCR-reaktioner med en SYBR Green master mix i henhold til producentens protokol.
BEMÆRK: Anvendte primere (EFNB2, GJA5, GJA4, NR2F2, EPHB4, HEY2) er angivet i tabel 1.
- For at analysere celler, der udtrykker FUCCI-konstruktionen ved flowcytometri, skal du udføre følgende trin.
- Aspirer væsken over cellerne og tilsæt 500 μL / godt 0,25% trypsin-EDTA.
- Inkubere cellerne ved 37 °C i en 5% CO2 -inkubator, indtil de løftes, ~ 5 min.
- Cellerne overføres til et mikrocentrifugerør, og cellerne pelleteres i en 4 °C mikrocentrifuge i 5 minutter ved 1.000 x g.
- Supernatanten aspireres, og pelleten resuspenderes i 500 μL iskold flowcytometrianalysebuffer.
- Træk prøverne gennem maskefilterhætten på et 5 ml FACS-rør, og opbevar cellerne på is, beskyttet mod lys, til øjeblikkelig flowcytometrianalyse.
- Analyser procentdelen af celler belagt på DLL4 vs. PBS-kontrol i tidlig G1 (ingen farve), sen G1 (mCherry + / mVenus-), G1 / S (mCherry + / mVenus +) og S / G2 / M (mCherry-/mVenus +).
- Udfør følgende trin for at analysere cellerne med qPCR.
6. Differentiering af hESC'er til hæmogene endotelceller
BEMÆRK: Differentier cellerne til dag 4 primordiale EC'er, som beskrevet ovenfor i afsnit 3.1-3.6.
- Dag 5: Aspirer mediet over cellerne og vask forsigtigt cellerne med 1 ml DMEM: F12 pr. Brønd. Tilsæt 1 ml frisklavet hæmogent endotelcelledifferentieringsmedium pr. Brønd og inkuber 24 timer (37 °C, 5% CO2).
- Dag 6: Mediet over cellerne udskiftes med 1 ml frisklavet hæmogent endotelcelledifferentieringsmedium pr. boring og inkuberes 24 timer (37 °C, 5 % CO2).
- Dag 7: Udskift mediet over cellerne med 1 ml frisklavet hæmogent endotelcelledifferentieringsmedium pr. Brønd og inkuber 24 timer (37 °C, 5% CO2).
- Dag 8: FACS isolerer hæmogene endotelceller (se punkt 7).
7. FACS-isolering af hæmogene endotelceller
- Cellerne løftes og vaskes som beskrevet ovenfor i punkt 4.1-4.6.
- Cellerne fordeles jævnt i mikrocentrifugerør på is, der hver indeholder mindst 600 μL celler ved 1 x 105 celler/ml, til antistoffarvning.
BEMÆRK: Otte rør af celler er påkrævet til antistoffarvning af hæmogene EC'er: ufarvet kontrol, CD31 enkelt antistofkontrol, CD45 enkelt antistofkontrol, KDR enkelt antistofkontrol, c-Kit enkelt antistofkontrol, CD34 enkelt antistofkontrol, VE-cadherin enkelt antistofkontrol og prøve indeholdende alle seks antistoffer.
BEMÆRK: Antistofoplysninger findes i Materialetabel. - Tilsæt antistoffer til rørene, der indeholder celler, alt efter hvad der er relevant, og inkuber på is og beskyttet mod lys i 30 minutter.
- Ufarvet kontrol: Tilsæt ikke antistof.
- CD31 enkelt antistofkontrol: Tilføj kun CD31-antistof.
- CD45 enkelt antistofkontrol: Tilføj kun CD45-antistof.
- KDR enkelt antistofkontrol: Tilføj kun KDR-antistof.
- c-Kit enkelt antistofkontrol: Tilføj kun c-Kit antistof.
- CD34 enkelt antistofkontrol: Tilføj kun CD34-antistof.
- VE-cadherin enkelt antistof kontrol: Tilføj kun VE-cadherin antistof.
- Eksempel: Tilføj CD31-, CD45-, KDR-, c-Kit-, CD34- og VE-cadherin-antistoffer.
BEMÆRK: Den endelige antistofkoncentration i prøven samt de fluorescerende konjugater bør optimeres baseret på de specifikke antistoffer og cellesorter, der anvendes.
- Cellerne pilles ved centrifugering i en 4 °C mikrocentrifuge i 5 minutter ved 1.000 x g.
- Supernatanten fjernes, og pelleterne genoptages i 600 μL iskold sorteringsbuffer.
- Si prøverne gennem maskefilterhætten på 5 ml FACS-rør, og opbevar celler på is, beskyttet mod lys, til øjeblikkelig FACS.
- For at opnå hæmogene endotelceller (CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin-CD45-), skal du udføre følgende trin.
- Identificer CD45-cellepopulationen og porten (CD45-).
- Inden for (CD45-) skal du identificere CD31+ cellepopulationen og porten (CD31+).
- Inden for (CD31+) identificeres VE-Cadherin-cellepopulationen og porten (CDH5-).
- Inden for (CDH5-), identificere c-Kit + cellepopulationen og porten (KIT +).
- Inden for (KIT +) skal du identificere CD34+ cellepopulationen og porten (CD34+).
- Inden for (CD34+) skal du identificere og sortere KDR+-cellerne i 6 ml iskolde cellesorteringsbuffer. Brug disse celler i downstream-applikationer (se afsnit 8).
8. Kolonidannende enhedsanalyse
- Optøning af alikvoterne for methylcellulosebaseret medium efter producentens anvisninger.
BEMÆRK: En 3 ml aliquot er tilstrækkelig til to prøver, og en 4 ml aliquot er tilstrækkelig til tre prøver. - Tæl de sorterede hæmogene endotelceller opnået i trin 7.7.
- I overensstemmelse med producentens anvisninger beregnes mængden af sorterede celler, der skal tilsættes til hver methylcellulosebaseret medium aliquot, således at hver prøve vil indeholde mindst 1.000 hæmogene endotelceller.
BEMÆRK: Antallet af celler kan justeres efter behov. - Tilsæt det beregnede volumen af celler til det methylcellulosebaserede medium aliquot og hvirvel grundigt. Lad de methylcellulosebaserede mellemkulturer sidde ved stuetemperatur i 10 minutter, eller indtil boblerne forsvinder.
- Aspirer fibronectinbelægningsopløsningen fra de tilberedte 35 mm skåle. Efter producentens anvisninger dispenseres 1 ml methylcellulosebaseret medium kultur pr. 35 mm skål. Drej forsigtigt fadet for jævnt at fordele kulturen.
- Placer disse 35 mm skåle samt to yderligere 35 mm skåle fyldt med sterilt vand i en 15 cm vævskulturskål.
- Inkuber kulturerne i en 37 °C, 5% CO2 inkubator, og observer kulturerne på dag 8 og 14.
- På dag 8 tælles CFU-E og BFU-E kolonierne.
- På dag 14 tælles CFU-GM og CFU-GEMM kolonierne.
BEMÆRK: Se den methylcellulosebaserede mediummanual til morfologisk identifikation af kolonityper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser en skematisk beskrivelse af specifikationen af oprindelige EC'er og hæmogene EC'er fra hESC'er og et repræsentativt billede af celler 24 timer efter plettering. Efter specifikation er primordiale EC'er og hæmogene EC'er FACS-renset på henholdsvis dag 5 og 8. Primordial EC'er er defineret som CD31+ CD45- og hæmogene EC'er er defineret som CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-. En repræsentativ flowcytometrisk gatingstrategi for primordiale EC'er og hæmogen EC-oprensning er vist i figur 2. Celler er oprindeligt gated baseret på den negative ekspression af CD45 og positiv ekspression af CD31 for at opnå oprensede primordiale EC'er (figur 2A). For at opnå oprensede hæmogene EC'er er celler oprindeligt gated som i figur 2A og derefter yderligere oprenset baseret på positiv eller negativ ekspression af (i rækkefølge) VE-Cadherin (CDH5), c-Kit (KIT), CD34 og KDR (figur 2B).
For at vurdere potentialet for H9-Fucci-hES-afledte primordiale CD31+ CD45-endotelceller, isoleret via FACS på dag 5 af differentiering (protokolafsnit 4), for at give anledning til endotelundertyper, podes de oprensede celler på plader belagt med enten Notch-liganden DLL4 for at inducere arteriel specifikation eller PBS (kontrol) og inkuberes i 24 timer i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Cellerne lyseres derefter med RNA-lysisbuffer, RNA'et ekstraheres og omvendt transkriberes til cDNA, og qPCR udføres for at sammenligne genekspressionsniveauer i de DLL4-behandlede vs. kontrolceller. Som forventet har endotelceller dyrket på DLL4 øget ekspression af det Notch-responsive gen HEY2 samt de arterielle associerede gener EFNB2, GJA5 og GJA4. Derudover har disse celler også nedsat ekspression af den venøse transkriptionsfaktor NR2F2 (figur 3A). Alternativt, for at bestemme effekten af DLL4-behandling på cellecyklustilstand, inkuberes FACS-rensede CD31 + CD45-celler på plader belagt med enten DLL4 eller PBS i 24 timer, løftes og analyseres baseret på ekspressionen af hCdt1 (30/120) -mCherry (sen G1) og hGam (1/110) -mVenus (S / G2 / M). I overensstemmelse med resultaterne om, at Notch-signalering fremmer sen G1-cellecyklusarrest27, arresteres en større procentdel af oprindelige EC'er i slutningen af G1 efter vækst i nærvær af DLL4 sammenlignet med kontrolceller (figur 3B, C).
For at verificere hæmatopoietisk potentiale af hæmogene endotelceller podes CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin-CD45- endotelceller isoleret gennem FACS (metoder i afsnit 7) i et methylcellulosebaseret medium formuleret til vækst af hæmatopoietiske stamceller i kolonidannende enhed (CFU) assays og får lov til at vokse i 14 dage. CFU-E erythroidkolonier og blastdannende enhed (BFU)-E erythroidkolonier tælles på dag 8 (figur 4A, B), og CFU-GM-granulocyt / makrofag og GFU-GEMM (granulocyt, erythroid, makrofag og megakaryocyt) multipotente hæmatopoietiske stamfaderkolonier tælles på dag 14 (figur 4C og D). Pr. 1.000 hæmogene EC'er forgyldt genereres ca. 20 CFU (figur 4F). Celler med endotelcellemorfologi kan også ses i kulturerne (figur 4E); Disse er de hæmogene endotelceller, der giver anledning til hæmatopoietiske forfædre med flere linjer på et enkeltcelleniveau37.
Figur 1: Protokol til specifikation af oprindelige og hæmogene EC'er . (A) Skematisk diagram over differentieringsprotokollen. Embryonale stamceller belægges på dag -1 på matrixproteinbelagte plader og får lov til at fastgøre natten over. Cellerne behandles derefter på dag 0 og 1 med henholdsvis GSK3i-hæmmer (CHIR99021) og bFGF for at inducere henholdsvis primitiv stribe og mesodermspecifikation. Fra dag 2 behandles cellerne med en kombination af BMP4 og VEGF-A for at fremme den oprindelige EF-udvikling. Primordial EC'er (rød cirkel) er FACS renset på dag 5. Alternativt, for at generere hæmogene EC'er, udveksles mediet over de oprindelige EC'er på dag 5 til frisk hæmogent differentieringsmedium indeholdende BMP4, VEGF-A og RA. Dette medium udskiftes dagligt indtil dag 8, hvor hæmogene EC'er (rød stjerne) renses FACS. (B) Kolonier på dag 0 af differentiering, skala bar = 100 μm. Panel A er blevet ændret fra Qiu et al.37 med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: FACS-analyse af hæmogene EC'er afledt af hESC'er. Repræsentativ flowcytometrisk gatingstrategi til oprensning af (A) oprindelige EC'er og (B) hæmogene EC'er. Bemærk, at da hæmogene EC'er er afledt af primordiale EC'er, er flowcytometri-gatingstrategien for CD45 og CD31 identisk for begge cellepopulationer. Vist i den øverste række af hvert panel (prøve) er celler, der blev differentieret til hæmogene EC'er som beskrevet i protokolafsnit 6 og farvet med antistoffer som beskrevet i protokolafsnit 7.3.8. Vist i nederste række af hvert panel (kontrol) er ufarvede celler, der blev differentieret i 8 dage uden RA-behandling. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: DLL4-induktion af H9-Fucci CD31+ CD45- primordiale endotelceller resulterer i sen G1-anholdelse og øget arteriel genekspression. (A) DLL4-behandling af CD31+ CD45- H9-hESC- afledte primordiale endotelceller, der udtrykker Fucci-konstruktionen oprenset på dag 5 af differentiering, resulterer i øget ekspression af arterielle gener (i-iii) og Notch-responsivt gen Hey2 (v), som ledsages af et samtidig fald i ekspressionen af venøst gen NR2F2 (iv). (B) Repræsentative FACS-plots, der viser cellecyklustilstandsfordelingen på 5.000 H9-Fucci-afledt CD31+ CD45- dyrket på PBS (kontrol) eller DLL4 i 24 timer. (C) DLL4-induktion resulterer i en stigning på 15% i celler i den sene G1-fase sammenlignet med kontrol. Data er gennemsnittet af tredobbelte prøver fra det samme eksperiment vist i panel (B). Fejllinjer angiver standardafvigelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Analyse af hæmatopoietisk potentiale af hæmogene EC'er afledt af hESC'er. Repræsentative billeder, der viser morfologi af H1-hESC afledt (A) CFU-E erythroidkoloni (skalabar = 35 μm), (B) BFU-E erythroidkoloni (skalabar = 75 μm), (C) CFU-GM granulocyt / makrofagkoloni, (D) CFU-GEMM multipotent hæmatopoietisk stamfaderkoloni og (E) CFU-GM granulocyt / makrofagkoloni med underliggende endotelceller (EC'er) (røde pile). (F) antal og fordeling af CFU'er dannet pr. 1.000 belagte hæmogene endotelceller. Skala bar = 100 μm in (C-E). Yderligere billeder af CFU'er differentieret ved hjælp af denne protokol kan findes i Qiu et al.37. Panel F er blevet ændret fra Qiu et al.37 med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Navn | Fremad | Omvendt |
| EFNB2 | TATGCAGAACTGCGATTTCCAA | TGGGTATAGTACCAGTCCTTGTC |
| Ephb4 | CGCACCTACGAAGTGTGA | GTCCGCATCGCTCATAGTA |
| GJA5 | CCGTGGTAGGCAAGGTCTG | ATCACACCGGAAATCAGCCTG |
| GJA4 | ACACCCACCCTGGTCTAC | CACTGGCGACATAGGTGCC |
| Hej2 | GCCCGCCCTTGTCAGTATC | CCAGGGTCGGTAAGGTTTATTG |
| NR2F2 | GGACCACATACGGATCTTCCAA | ACATCAGACAGACCACAGGCAT |
Tabel 1: qPCR-primeroplysninger
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heri skitseres trinene til fremstilling af hæmogene endotelceller fra humane embryonale stamceller på ca. 1 uge ved hjælp af et murinfoder- og serumfrit 2D-kultursystem (figur 1). Denne protokol udvider en metode beskrevet af Sriram et al. (2015) for at opnå primordial ECs38. CD31+ CD45-EC'ernes oprindelige karakter og specifikationspotentiale demonstreres ved at dyrke disse celler på DLL4-belagte plader og observere ændringer i genekspression i overensstemmelse med arteriel specifikation (figur 3). Derudover er opnåelsen af arteriel identitet forbundet med sen G1-cellecyklusstop (figur 3), hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser27. Efter dyrkning af oprindelige EC'er i yderligere 3 dage i nærværelse af 0,5 μM RA, 25 ng / ml BMP4 og 50 ng / mL VEGF-A var det muligt at generere og FACS-isolere hæmogene EC'er (figur 2), der er i stand til at give anledning til CFU-erythroid, BFU-erythroid, CFU-granulocyt / makrofag og CFU-granulocyt-, erythrocyt-, makrofag- og megakaryocytkolonier (figur 4 ). Ved hjælp af denne metode i en nyligt offentliggjort undersøgelse blev genekspressionsændringer over en 8-dages tidsperiode i overensstemmelse med tab af pluripotens, primitiv stribe og mesoderminduktion, erhvervelse af endotelcelleidentitet og endelig hæmatopoietisk identitet observeret37. Desuden inducerede RA-behandling tidlig G1-cellecyklusstop for at muliggøre hæmogen EC-specifikation37.
For nylig beskrev Ohta et al. (2019) en protokol til differentiering af hæmogene EC'er fra hPSC'er39. Protokollen beskrevet ovenfor giver imidlertid betydelige fordele: 1) denne metode kræver ikke dannelse af sfæroider; 2) denne protokol anvender en standard 37 ° C, 5% CO2 inkubator snarere end en hypoxisk inkubator, hvilket eliminerer behovet for dedikeret specialudstyr; og 3) denne protokol bruger kun et medium (pluripotent stamcelledifferentieringsmedium suppleret med PFHM), en omkostningsbesparende fordel, mens Ohta-protokollen kræver to medier til induktion. En anden nyligt offentliggjort undersøgelse af Galat et al. (2017) beskrev en protokol, hvor CHIR99021 induktion blev brugt til at generere en population af CD34+ hæmogene endotelceller40. Disse celler udtrykte også CD31 og var i stand til at give anledning til endotelceller, når de blev dyrket under monolagsbetingelser eller celler, der udtrykte myeloide og lymfoide markører efter samdyrkning med henholdsvis OP9- eller OP9-DLL4-celler i nærvær af yderligere cytokiner. Kravet om yderligere samkultur kan føre til potentiel forurening af ønskede cellepopulationer med murinceller. Derudover, selvom Ohta et al. og Galat et al. anvendte en hæmogen induktionsperiode, der var kortere end den, der er beskrevet her (henholdsvis 4 dage og 5 dage vs. 8 dage), definerede begge hæmogene EC'er som CD34+, mens denne protokol anvendte en strengere definition: CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45- . Mens CD34 anerkendes som en markør for hæmatopoietiske celler, udtrykkes den også af andre ikke-hæmatopoietiske celletyper, såsom mesenkymale stromale celler og endotelceller41. Definitionen af hæmogene EC'er i denne protokol (CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin-CD45-) er derfor strengere og repræsenterer en mere defineret population.
En begrænsning for brugen af hESC'er eller hiPSC'er i terapeutiske applikationer er det store antal celler, der kræves, og standard 2D-afledningsmetoder er primært begrænset til små differentieringer. Ved hjælp af hiPSC-linjer demonstrerede Olmer et al. (2018) muligheden for at opskalere produktionen af funktionelle CD31+ EC'er, der udtrykte både arterielle (DLL4) og venøse (EPHB4) cellemarkører ved hjælp af enten suspensionskultur eller en omrørt tankbioreaktor6. Det er vigtigt, at de viste, at de var i stand til at opnå 1,18 x 107 CD31+ EC'er, der co-express CD34 og KDR fra en enkelt kolbe indeholdende 20 ml suspensionskultur. For at opnå de nødvendige 3 x 108 EC, der er nødvendige for de fleste terapeutiske anvendelser, kræves der lidt over to 500 ml kolber6. Fremtidige eksperimenter bør undersøge anvendelsen af skaleringsteknikker på den protokol, der præsenteres her for storskala produktion af hæmogene EC'er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af NIH-tilskud HL128064 og U2EB017103. Yderligere støtte blev ydet af CT Innovations 15-RMB-YALE-04 tilskud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 cm dishes | Corning | 430599 | tissue culture treated |
| 35 mm dishes | Corning | 430165 | tissue culture treated |
| 6-well plates | Corning | 3516 | tissue culture treated |
| Antimicrobial reagent Brand Name: Normocin |
Invitrogen | ant-nr-1 | |
| bFGF | R&D systems | 233-FB-025 | use at 50 ng/mL |
| BMP4 | BioLegend | 595202 | use at 25 ng/mL |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-1 | |
| Cell Detatchment Solution Brand Name: Accutase |
Stemcell Technologies | 7920 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7913 | |
| DLL4 | R&D systems | 1506-D4/CF | recombinant human; use at 10 μg/mL |
| DMEM:F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Endothelial cell growth medium Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2) |
Lonza | CC-3162 | |
| FACS tubes | Corning | 352235 | polystyrene round bottom with filter cap |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
| Fibronectin | ThermoFisher Scientific | 33016015 | use at 4 μg/cm2 |
| GSK3i/CHIR99021 | Stemgent | 04-0004-02 | 10 mM stock; use at 5 μM |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175-095 | |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Matrix protein Brand Name: Matrigel |
Corning | 356230 | Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein. |
| Methylcellulose-based medium Brand Name: MethoCult H4435 Enriched |
Stemcell Technologies | 4435 | |
| Pluripotent stem cell differentiation medium Brand Name: STEMdiff APEL 2 |
Stemcell Technologies | 5270 | |
| Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI | WiCell | WA09 (H9), WA01 (H1) | human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier's lab at Cambridge Stem Cell Institute |
| Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH) | Gibco | 12040077 | |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625-50mg | use at 0.5 μM |
| Reverse transcription master mix Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix |
BioRad | 1708840 | |
| RNA extraction kit Brand Name: RNeasy Mini Kit |
Qiagen | 74104 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Stem cell growth medium Brand Name: mTeSR1 |
Stemcell Technologies | 85850 | |
| SYBR Green master mix Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix |
BioRad | 1725121 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25299956 | 0.25% |
| VEGF165 (VEGF-A) | PeproTech | 100-20 | use at 50 ng/mL |
| α-CD31-FITC | BioLegend | 303104 | 2 μg/mL* |
| α-CD34-Pacific Blue | BioLegend | 343512 | 2 μg/mL* |
| α-CD45-APC/Cy7 | BioLegend | 304014 | 2 μg/mL* |
| α-c-Kit-APC | BioLegend | 313206 | 2 μg/mL* |
| α-Flk-1-PE/Cy7 | BioLegend | 359911 | 2 μg/mL* |
| α-VE-Cadherin-PE | BioLegend | 348506 | 2 μg/mL* |
| * Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study. |
References
- Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
- Wu, J., Wu, Z., Xue, Z., Li, H., Liu, J. PHBV/bioglass composite scaffolds with co-cultures of endothelial cells and bone marrow stromal cells improve vascularization and osteogenesis for bone tissue engineering. RSC Advances. 7 (36), 22197-22207 (2017).
- Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Microvasculature: An essential component for organ-on-chip systems. MRS Bulletin. 39 (1), 51-59 (2014).
- Gritz, E., Hirschi, K. K. Specification and function of hemogenic endothelium during embryogenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (8), 1547-1567 (2016).
- Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells: Methods, considerations, and applications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
- Olmer, R., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional endothelial cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 10 (5), 1657-1672 (2018).
- Cossu, G., et al. Lancet Commission: Stem cells and regenerative medicine. The Lancet. 391 (10123), 883-910 (2018).
- Fox, I. J., et al. Use of differentiated pluripotent stem cells in replacement therapy for treating disease. Science. 345 (6199), 1247391 (2014).
- Mahla, R. S. Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics. International Journal of Cell Biology. 2016, 1-24 (2016).
- Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
- Rowe, R. G., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
- Wnorowski, A., Yang, H., Wu, J. C. Progress, obstacles, and limitations in the use of stem cells in organ-on-a-chip models. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 3-11 (2019).
- Ramme, A. P., et al. Autologous induced pluripotent stem cell-derived four-organ-chip. Future Science OA. 5 (8), 1-12 (2019).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Kane, N. M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells by directed differentiation: analysis of microrna and angiogenesis in vitro and in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (7), 1389-1397 (2010).
- Costa, M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells in fully defined medium enables identification of lysophosphatidic acid and platelet activating factor as regulators of eNOS localization. Stem Cell Research. 10 (1), 103-117 (2013).
- Nguyen, M. T. X., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to endothelial progenitor cells on laminins in defined and xeno-free systems. Stem Cell Reports. 7 (4), 802-816 (2016).
- Ikuno, T., et al. Efficient and robust differentiation of endothelial cells from human induced pluripotent stem cells via lineage control with VEGF and cyclic AMP. PLOS One. 12 (3), 0173271 (2017).
- Aoki, H., et al. Efficient differentiation and purification of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells and expansion with the use of inhibitors of ROCK, TGF-B, and GSK3B. Heliyon. 6 (3), 03493 (2020).
- Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of Wnt signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
- Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).
- Kusuma, S., Gerecht, S. Derivation of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells. Human Embryonic Stem Cell Protocols. Turksen, K. , Humana Press. New York, NY. 213-222 (2014).
- Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via wnt activation under defined conditions. Methods in Molecular Biology. 1481, 183-196 (2016).
- Xu, M., He, J., Zhang, C., Xu, J., Wang, Y. Strategies for derivation of endothelial lineages from human stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 200 (2019).
- Arora, S., Yim, E. K. F., Toh, Y. -C. Environmental specification of pluripotent stem cell derived endothelial cells toward arterial and venous subtypes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 143 (2019).
- Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communications. 8 (1), 2149 (2017).
- Dalton, S. Linking the cell cycle to cell fate decisions. Trends in Cell Biology. 25 (10), 592-600 (2015).
- Wolf, K., Hu, H., Isaji, T., Dardik, A. Molecular identity of arteries, veins, and lymphatics. Journal of Vascular Surgery. 69 (1), 253-262 (2019).
- Rocha, S. F., Adams, R. H. Molecular differentiation and specialization of vascular beds. Angiogenesis. 12 (2), 139-147 (2009).
- Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis. Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).
- Chanda, B., Ditadi, A., Iscove, N. N., Keller, G. Retinoic acid signaling is essential for embryonic hematopoietic stem cell development. Cell. 155 (1), 215-227 (2013).
- Marcelo, K. L., et al. Hemogenic endothelial cell specification requires c-kit, notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control. Developmental Cell. 27 (5), 504-515 (2013).
- Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. The molecular basis of endothelial cell plasticity. Nature Communications. 8 (1), 14361 (2017).
- Ottersbach, K. Endothelial-to-haematopoietic transition: an update on the process of making blood. Biochemical Society Transactions. 47 (2), 591-601 (2019).
- Pauklin, S., Vallier, L. The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity. Cell. 155 (1), 135-147 (2013).
- Qiu, J., Nordling, S., Vasavada, H. H., Butcher, E. C., Hirschi, K. K. Retinoic acid promotes endothelial cell cycle early g1 state to enable human hemogenic endothelial cell specification. Cell Reports. 33 (9), 108465 (2020).
- Sriram, G., Tan, J. Y., Islam, I., Rufaihah, A. J., Cao, T. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to arterial and venous endothelial cells under feeder- and serum-free conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 261 (2015).
- Ohta, R., Sugimura, R., Niwa, A., Saito, M. K. Hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59823 (2019).
- Galat, Y., et al. Cytokine-free directed differentiation of human pluripotent stem cells efficiently produces hemogenic endothelium with lymphoid potential. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 67 (2017).
- Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: Evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), Dayton, Ohio. 1380-1389 (2014).
