इन विट्रो E3 सर्वव्यापकिन लिगाज़ समारोह का विश्लेषण
Summary
वर्तमान अध्ययन E3 सर्वव्यापकता लिगाज़ उत्प्रेरक गतिविधि के विश्लेषण के लिए विट्रो सर्वव्यापकता परख प्रोटोकॉल में विस्तृत प्रदान करता है। रेशेरिचिया कोलाई संस्कृति जैसे प्रोकैरियोटिक सिस्टम का उपयोग करके रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन व्यक्त किए गए थे।
Abstract
सब्सट्रेट प्रोटीन के आंतरिक lysine अवशेषों (एस) के लिए सर्वव्यापक लगाव, सर्वव्यापी कहा जाता है, यूकेरियोटिक जीवों में सबसे महत्वपूर्ण अनुवादात्मक संशोधनों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है। सर्वव्यापकता को तीन एंजाइम वर्गों के अनुक्रमिक झरने द्वारा मध्यस्थता की जाती है जिनमें सर्वव्यापकता-सक्रिय एंजाइम (ई 1 एंजाइम), सर्वव्यापक एंजाइम (E2 एंजाइम), और सर्वव्यापक लिगैस (ई 3 एंजाइम), और कभी-कभी, सर्वव्यापकइन-चेन एल्गोंगेशन कारक (ई 4 एंजाइम) शामिल हैं। यहां, सर्वव्यापकता परख के लिए इन विट्रो प्रोटोकॉल प्रदान किए जाते हैं, जो E3 सर्वव्यापकता लिगाज़ गतिविधि के आकलन, E2-E3 जोड़े के बीच सहयोग, और सब्सट्रेट चयन की अनुमति देते हैं। सहयोग E2-E3 जोड़े मुक्त पाली-सर्वव्यापकता श्रृंखला की पीढ़ी की निगरानी और/या E3 ligase के ऑटो सर्वव्यापकता द्वारा जांच की जा सकती है । सब्सट्रेट सर्वव्यापकता को E3 ligase के चयनात्मक बाध्यकारी द्वारा परिभाषित किया गया है और इन विट्रो प्रतिक्रिया के पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा पता लगाया जा सकता है। इसके अलावा, एक E2 ~ Ub निर्वहन परख वर्णित है, जो कार्यात्मक E2-E3 सहयोग के प्रत्यक्ष आकलन के लिए एक उपयोगी उपकरण है । यहां, सर्वव्यापकता के E3-निर्भर हस्तांतरण को इसी E2 एंजाइम से मुफ्त में लिसिन अमीनो एसिड (नकल करने वाले सब्सट्रेट सर्वव्यापकता) या ई 3 लिगाज़ के आंतरिक लिसिन (ऑटो-सर्वव्यापकता) पर पीछा किया जाता है। अंत में, तीन अलग-अलग इन विट्रो प्रोटोकॉल प्रदान किए जाते हैं जो E3 लिगाज़ उत्प्रेरक कार्यक्षमता को संबोधित करने के लिए तेजी से और आसान प्रदर्शन करने के लिए हैं।
Introduction
सर्वव्यापकता वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा यूबी को सब्सट्रेट प्रोटीन 1 से सहसंबद्ध रूप से जोड़ाजाताहै । यूबी संशोधन को लगातार एंजाइम वर्गों, यानीयूबी-एक्टिवेट एंजाइम (E1s), यूबी-कंजूगेटिंग एंजाइम (E2s), यूबी लिगिस (E3s), और संभवतः यूबी चेन स्फूर्ति कारकों (E4s)2,3,4,5की कार्रवाई से जुड़े द्वारा उत्प्रेरित किया जाता है। एडेनोसाइन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) और मैग्नीशियम (एमजी2+)के बाद- ई 1 द्वारा यूबी की निर्भर सक्रियता, ई1 की सक्रिय साइट सिस्टीन यूबी के सी-टर्मिनल ग्लाइसिन पर हमला करती है, जो एक थिओएस्टर कॉम्प्लेक्स (यूबी ~ ई 1) बनाती है। एटीपी हाइड्रोलिसिस से तैयार ऊर्जा यूबी को एक उच्च ऊर्जा संक्रमणकालीन स्थिति प्राप्त करने का कारण बनती है, जिसे पूरे निम्नलिखित एंजाइम झरना में बनाए रखा जाता है। इसके बाद, ई 2 एंजाइम सक्रिय यूबी को अपने आंतरिक उत्प्रेरक सिस्टीन में स्थानांतरित करता है, जिससे क्षणिक यूबी ~ ई 2 थिओस्टर बॉन्ड बन जाता है। इसके बाद, यूबी को सब्सट्रेट प्रोटीन में स्थानांतरित कर दिया जाता है।
यह दो तरह से किया जा सकता है। या तो E3 ligase पहले E2 के लिए बाध्य कर सकते हैं, या E3 ligase सीधे यूबी बांध सकते हैं । बाद के रास्ते एक E3 ~ Ub मध्यवर्ती के गठन में परिणाम है । किसी भी मामले में, यूबी को यूबी के सी-टर्मिनल कार्बोक्सिल समूह और सब्सट्रेट 6 के लिसाइन Ɛ-अमीनो समूह के बीच आइसोपेटाइड बॉन्ड के गठन से सब्सट्रेट प्रोटीन से जोड़ाजाताहै। मानव जीनोम दो E1s, लगभग 40 E2s, और 600 से अधिक ख्यात सर्वव्यापकाइन li गैसों7encodes। E3 के यूबी हस्तांतरण तंत्र के आधार पर, यूबी लि गैसों को तीन श्रेणियों में विभाजित किया गया है जिसमें E6AP सी-टर्मिनस (हेक्ट))- प्रकार, वास्तव में दिलचस्प नए जीन (रिंग) /यू-बॉक्स-प्रकार, और रिंग (आरबीआर) के बीच रिंग (आरबीआर) प्रकार लीगैसों 8के मुताबिक़ शामिल हैं। इस अध्ययन में, एचएससी 70-इंटरैक्टिंग प्रोटीन (चिप) के लिगाज़, कार्बोक्सिल टर्मिनस युक्त यू-बॉक्स का उपयोग प्रतिनिधि E3 एंजाइम के रूप में किया जाता है। एचईसीटी-प्रकार के ई 3 एंजाइमों के विपरीत जो यूबी ~ E3 थिओएस्टर्स बनाते हैं, चिप का यू-बॉक्स डोमेन E2 ~ यूबी को बांधता है और बाद में यूबी/सब्सट्रेट ट्रांसफर को सीधे E2 एंजाइम8,9से बढ़ावा देता है। एंजाइमेटिक फ़ंक्शन के लिए यू-बॉक्स के महत्व के आधार पर, एक निष्क्रिय चिप यू-बॉक्स उत्परिवर्ती, चिप (H260Q), एक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है। चिप (H260Q) अपने कॉग्नेट E2s को बांधने में विफल रहता है, इस प्रकार अपनी E3 ligase गतिविधि10खोने ।
प्रोटीन सर्वव्यापकता यूकेरियोटिक कोशिकाओं में सेलुलर घटनाओं की एक भीड़ को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। सेलुलर परिणामों की विविधता है कि यूबी अणुओं के रिवर्सिबल लगाव द्वारा प्रोटीन सब्सट्रेट करने के लिए पदोंनत कर रहे है यूबी की आणविक विशेषताओं के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । चूंकि यूबी में ही आगे सर्वव्यापकता के लिए सात lysine (K) अवशेष होते हैं, इसलिए विभिन्न आकारों और/या टोपोलॉजी11के साथ यूबी चेन-प्रकारों की समृद्ध विविधता है । उदाहरण के लिए, सब्सट्रेट्स को एक (मोनो-सर्वव्यापकता) या मल्टीपल लिसाइन (मल्टी मोनो-सर्वव्यापकता) पर एक ही यूबी अणु द्वारा संशोधित किया जा सकता है, और यहां तक कि यूबी चेन (पॉली-सर्वव्यापकता)11द्वारा भी। यूबी चेन या तो यूबी के समान या विभिन्न lysine अवशेषों के माध्यम से होमो-या विषम रूप से गठित किए जाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप शाखाबद्ध यूबी चेन9भी हो सकती है। इस प्रकार, प्रोटीन सर्वव्यापकता से यूबी अणुओं की विविध व्यवस्थाएं होती हैं, उदाहरणके लिए, संयुग्मित प्रोटीन12, 13के क्षरण, सक्रियण या स्थानीयकरण के लिए विशिष्ट जानकारी प्रदान करते हैं। ये विभिन्न यूबी सिग्नल सेलुलर सिग्नलिंग रास्तों के तेजी से पुनर्प्रोग्रामिंग को सक्षम करते हैं, जो बदलती पर्यावरणीय जरूरतों का जवाब देने की कोशिका की क्षमता के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है।
सर्वव्यापकता का एक केंद्रीय पहलू प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण से संबंधित है। गलत ढंग से क्षतिग्रस्त या अपरिवर्तनीय रूप से क्षतिग्रस्त प्रोटीन को अपमानित किया जाना चाहिए और उसकी जगह नए संश्लेषित प्रोटीन द्वारा प्रोटीन होरोस्टेसिस या प्रोटेओस्टेसिस14को बनाए रखने के लिए किया जाना चाहिए । गुणवत्ता नियंत्रण E3 ligase, चिप, क्षतिग्रस्त प्रोटीन9,15, 16, 17के यूबी-निर्भर क्षरण में आणविक चैपरोन के साथ सहयोग करता है। इसके अलावा, चिप मायोसिन-निर्देशित चैपरवन, यूएनसी-45बी (यूएनसी-45 होमोलॉग बी) की स्थिरता को नियंत्रित करता है, जो मांसपेशियों के कार्य और इष्टतम स्तरों से विचलन के साथ कसकर समन्वित होता है जिससे मानव मायोपैथी18,19,20, 21होजातीहै। 26S प्रोटेसोम द्वारा यूएनसी-45बी का क्षरण K48-लिंक्ड पॉली-यूबी चेन9के लगाव से मध्यस्थता की जाती है । सब्सट्रेट प्रोटीन के अभाव में, चिप ऑटो-सर्वव्यापकता10,22,23करता है, जो रिंग/यू-बॉक्स E3 सर्वव्यापी लिगिस24, 25की विशेषता है और लिगाज़ गतिविधि को विनियमित करने के लिए विचार कियाजाता है26। इस पेपर में वर्णित इन विट्रो सर्वव्यापकता परख विधियों के आवेदन ने E2 एंजाइमों की व्यवस्थित रूप से पहचान करने में मदद की जो चिप के साथ मुक्त पॉली-यूबी चेन और/या ऑटो-सर्वव्यापकता चिप (प्रोटोकॉल धारा 2) के गठन को बढ़ावा देने के लिए टीम करते हैं । इसके अलावा, यूएनसी-45B के चिप-निर्भर सर्वव्यापकता देखी गई, जो E3 ligase18, 19 (प्रोटोकॉल धारा 3) का एक ज्ञात सब्सट्रेट है। अंततः, यूबी ~ E2 थिओस्टर से सक्रिय यूबी के चिप-निर्भर हस्तांतरण की निगरानी की गई (प्रोटोकॉल धारा 4)।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह पेपर E3 ligase समारोह के विश्लेषण के लिए बुनियादी इन विट्रो सर्वव्यापकता विधियों का वर्णन करता है। इन विट्रो सर्वव्यापकता परखते समय, यह माना जाना चाहिए कि कुछ ई-2 एंजाइम अपने स्वयं के लिसाइन अवशेषो…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि पर महत्वपूर्ण चर्चा और सहायक सलाह के लिए हमारी प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं । हम आकार सीमा के कारण मूल्यवान योगदान का हवाला नहीं देने के लिए माफी मांगते हैं । इस काम को ड्यूश फोर्चुंग्स्जेमीस्चफ्ट (डीएफजी, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) – एसएफबी 1218 – प्रोजेक्टनंबर 269925409 और क्लस्टर ऑफ एक्सीलेंस एक्ससी 229/ इस काम को जर्मनी की उत्कृष्टता रणनीति के तहत ड्यूश फोर्स्चुंग्सगेमेन्चेफ्ट (डीएफजी, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) द्वारा वित्त पोषित किया गया था -EXC 2030 – 390661388 और – एसएफबी 1218 – प्रोजेक्टनंबर 269925409 टी एच Diese Arbeit wurde वॉन डेर ड्यूशेन Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie-EXC २०३०-390661388 und-SFB १२१८-Projektnummer: 269925409 एक एच gefördert ।
Materials
| Amershan Protran 0.1 µm NC | GE Healthcare | 10600000 | nitrocellulose membrane |
| Anti-CHIP | Cell Signaling | 2080 | Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6 |
| Anti-MYC | Roche | OP10 | Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10 |
| Anti-ubiquitin | Upstate | 05-944 | Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11 |
| Apyrase | Sigma | A6535-100UN | |
| ATP (10x) | Enzo | 12091903 | |
| BSA | Sigma | A6003-10G | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| KCl | Roth | 6781.1 | |
| K2HPO4 | Roth | P749.2 | |
| KH2PO4 | Roth | 3904.1 | |
| LDS sample buffer (4x) | novex | B0007 | |
| L-Lysine | Sigma | L5501-5G | |
| MES | Roth | 4256.4 | |
| MeOH | VWR Chemicals | 2,08,47,307 | 100% |
| Milchpulver | Roth | T145.3 | |
| NaCl | Roth | P029.3 | |
| NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | |
| NuPAGE Transfer buffer (20x) | novex | NP0006-1 | |
| Page ruler plus | Thermo Fisher | 26619 | Protein ladder |
| RotiBlock | Roth | A151.1 | Blocking reagent |
| SDS (20%) | Roth | 1057.1 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio Rad | 1852196 | |
| Trans-Blot Turbo | Bio Rad | 1704150EDU | Transfer system |
| Tris base | Roth | 4855.3 | |
| Tween 20 | Roth | 9127.2 | |
| UbcH Enzyme Set | BostonBiochem | K-980B | E2 enzymes |
| Ubiquitin | BostonBiochem | U-100H | |
| Ubiquitin-activating enzyme E1 | Enzo | BML-UW941U-0050 | |
| Ubiquitylation buffer (10x) | Enzo | BML-KW9885-001 | |
| Whatman blotting paper | Bio Rad | 1703969 | Extra thick filter paper |
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