In vitro Analisi della funzione E3 Ubiquitina ligasi
Summary
Il presente studio fornisce protocolli dettagliati di test di ubiquitilazione in vitro per l’analisi dell’attività catalitica dell’ubiquitina ligasi E3. Le proteine ricombinanti sono state espresse utilizzando sistemi procariotici come la coltura di Escherichia coli.
Abstract
L’attaccamento covalente dell’ubiquitina (Ub) ai residui interni di lisina di una proteina substrato, un processo chiamato ubiquitilazione, rappresenta una delle più importanti modificazioni post-traduzionali negli organismi eucariotici. L’ubiquitilazione è mediata da una cascata sequenziale di tre classi enzimatiche tra cui enzimi attivanti l’ubiquitina (enzimi E1), enzimi coniuganti l’ubiquitina (enzimi E2) e ligasi di ubiquitina (enzimi E3) e, a volte, fattori di allungamento della catena dell’ubiquitina (enzimi E4). Qui vengono forniti protocolli in vitro per saggi di ubiquitilazione, che consentono la valutazione dell’attività dell’ubiquitina ligasi E3, la cooperazione tra coppie E2-E3 e la selezione del substrato. Le coppie E2-E3 cooperanti possono essere sottoposte a screening monitorando la generazione di catene libere di poli-ubiquitina e/o l’auto-ubiquitilazione della ligasi E3. L’ubiquitilazione del substrato è definita dal legame selettivo della ligasi E3 e può essere rilevata mediante western blotting della reazione in vitro. Inoltre, viene descritto un saggio di scarica E2~Ub, che è uno strumento utile per la valutazione diretta della cooperazione funzionale E2-E3. Qui, il trasferimento E3-dipendente dell’ubiquitina è seguito dal corrispondente enzima E2 su amminoacidi liberi di lisina (che imitano l’ubiquitilazione del substrato) o lisine interne della stessa ligasi E3 (auto-ubiquitilazione). In conclusione, vengono forniti tre diversi protocolli in vitro che sono veloci e facili da eseguire per affrontare la funzionalità catalitica della ligasi E3.
Introduction
L’ubiquitilazione è il processo mediante il quale Ub è legato covalentemente a una proteina substrato1. La modificazione Ub è catalizzata da successive reazioni enzimatiche che coinvolgono l’azione di tre diverse classi enzimatiche,ovvero enzimi Ub-attivanti (E1s), enzimi Ub-coniuganti (E2s), Ub ligasi (E3s), ed eventualmente fattori di allungamento della catena Ub (E4s)2,3,4,5. Dopo l’attivazione dipendente da adenosina trifosfato (ATP) e magnesio (Mg2+) di Ub da parte di E1, la cisteina del sito attivo di E1 attacca la glicina C-terminale di Ub, formando un complesso tioestere (Ub ~ E1). L’energia prelevata dall’idrolisi dell’ATP fa sì che l’Ub raggiunga uno stato di transizione ad alta energia, che viene mantenuto durante la seguente cascata enzimatica. Successivamente, l’enzima E2 trasferisce l’Ub attivato alla sua cisteina catalitica interna, formando così un legame tioestere transitorio Ub~E2. Successivamente, Ub viene trasferito alla proteina del substrato.
Questo può essere fatto in due modi. O la ligasi E3 può prima legarsi a E2, o la ligasi E3 può legare direttamente Ub. Quest’ultimo modo si traduce nella formazione di un intermedio E3 ~ Ub. In entrambi i casi, Ub è legato alla proteina del substrato dalla formazione di un legame isopeptidetico tra il gruppo carbossilico C-terminale di Ub e il gruppo lisina Ɛ-amminico del substrato6. Il genoma umano codifica due E1, circa 40 E2 e più di 600 presunte ubiquitina ligasi7. Sulla base del meccanismo di trasferimento Ub dell’E3, le Ub ligasi sono divise in tre categorie che coinvolgono il tipo Omologo a E6AP C-Terminus (HECT), il tipo Really Interesting New Gene (RING) / U-box e RING tra le ligasi di tipo RING (RBR)8. In questo studio, l’U-box contenente ligasi, Carboxyl Terminus of HSC70-interacting Protein (CHIP), viene utilizzato come enzima E3 rappresentativo. A differenza degli enzimi E3 di tipo HECT che formano i tioesteri Ub~E3, il dominio U-box di CHIP lega E2~Ub e promuove il successivo trasferimento Ub/substrato direttamente dall’enzima E28,9. Sulla base dell’importanza della U-box per la funzione enzimatica, un mutante CHIP U-box inattivo, CHIP (H260Q), viene utilizzato come controllo. CHIP (H260Q) non riesce a legarsi ai suoi affini E2, perdendo così la sua attività di legasi E310.
L’ubiquitilazione proteica svolge un ruolo cruciale nella regolazione di una moltitudine di eventi cellulari nelle cellule eucariotiche. La diversità dei risultati cellulari promossi dall’attaccamento reversibile delle molecole Ub alle proteine del substrato può essere attribuita alle caratteristiche molecolari di Ub. Poiché Ub stesso contiene sette residui di lisina (K) per un’ulteriore ubiquitilazione, esiste una ricca varietà di tipi di catene Ub con diverse dimensioni e / o topologie11. Ad esempio, i substrati possono essere modificati da una singola molecola Ub a uno (mono-ubiquitilazione) o lisine multiple (multi mono-ubiquitilazione), e persino da catene Ub (poli-ubiquitilazione)11. Le catene Ub sono formate omo- o eterotipicamente attraverso lo stesso o diversi residui di lisina di Ub, che potrebbero anche provocare catene Ub ramificate9. Pertanto, l’ubiquitilazione proteica porta a diverse disposizioni di molecole Ub che forniscono informazioni specifiche, ad esempioper la degradazione, l’attivazione o la localizzazione delle proteine coniugate12,13. Questi diversi segnali Ub consentono una rapida riprogrammazione delle vie di segnalazione cellulare, che è un requisito importante per la capacità della cellula di rispondere alle mutevoli esigenze ambientali.
Un aspetto centrale dell’ubiquitilazione è legato al controllo della qualità delle proteine. Le proteine mal ripiegate o irreversibilmente danneggiate devono essere degradate e sostituite da proteine di nuova sintesi per mantenere l’omeostasi proteica o la proteostasi14. Il controllo qualità E3 ligasi, CHIP, collabora con chaperoni molecolari nella degradazione Ub-dipendente delle proteine danneggiate9,15,16,17. Oltre a ciò, CHIP regola la stabilità dell’accompagnatore diretto dalla miosina, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), che è strettamente coordinato con la funzione muscolare e le deviazioni dai livelli ottimali portano alla miopatia umana18,19,20,21. La degradazione di UNC-45B da parte del proteasoma 26S è mediata dall’attaccamento di una catena poli-Ub legata a K489. In assenza di proteine del substrato, CHIP esegue l’auto-ubiquitilazione10,22,23,che è caratteristica delle ligasi ubiquitina RING/U-box E324,25 e considerata regolatrice dell’attività della ligasi26. L’applicazione dei metodi di saggio di ubiquitilazione in vitro descritti in questo articolo ha contribuito a identificare sistematicamente gli enzimi E2 che si uniscono a CHIP per promuovere la formazione di catene poli-Ub libere e / o l’auto-ubiquitilazione di CHIP (sezione 2 del protocollo). Inoltre, è stata osservata ubiquitilazione CHIP-dipendente di UNC-45B, che è un substrato noto della ligasi E318,19 (sezione 3 del protocollo). In definitiva, è stato monitorato il trasferimento dipendente da CHIP di Ub attivato dal tioestere Ub~E2 (sezione 4 del protocollo).
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo descrive i metodi di ubiquitilazione di base in vitro per l’analisi della funzione della ligasi E3. Quando si eseguono saggi di ubiquitilazione in vitro, si deve considerare che alcuni enzimi E2 possono eseguire l’auto-ubiquitilazione a causa dell’attacco della loro cisteina attiva sui propri residui di lisina che si trovano in prossimità del sito attivo30. Per aggirare questo problema, si raccomanda l’uso di un mutante E2 in cui il rispettivo residuo di lisina v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del nostro laboratorio per la discussione critica e i consigli utili sul manoscritto. Ci scusiamo per non aver citato contributi preziosi a causa della limitazione delle dimensioni. Questo lavoro è sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione tedesca per la ricerca) – SFB 1218 – Projektnumber 269925409 e Cluster of Excellence EXC 229/ CECAD to TH. Questo lavoro è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) nell’ambito della Strategia di eccellenza della Germania – EXC 2030 – 390661388 e – SFB 1218 – Projektnumber 269925409 a T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie – EXC 2030 – 390661388 und – SFB 1218 – Projektnummer: 269925409 an T.H. gefördert.
Materials
| Amershan Protran 0.1 µm NC | GE Healthcare | 10600000 | nitrocellulose membrane |
| Anti-CHIP | Cell Signaling | 2080 | Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6 |
| Anti-MYC | Roche | OP10 | Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10 |
| Anti-ubiquitin | Upstate | 05-944 | Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11 |
| Apyrase | Sigma | A6535-100UN | |
| ATP (10x) | Enzo | 12091903 | |
| BSA | Sigma | A6003-10G | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| KCl | Roth | 6781.1 | |
| K2HPO4 | Roth | P749.2 | |
| KH2PO4 | Roth | 3904.1 | |
| LDS sample buffer (4x) | novex | B0007 | |
| L-Lysine | Sigma | L5501-5G | |
| MES | Roth | 4256.4 | |
| MeOH | VWR Chemicals | 2,08,47,307 | 100% |
| Milchpulver | Roth | T145.3 | |
| NaCl | Roth | P029.3 | |
| NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | |
| NuPAGE Transfer buffer (20x) | novex | NP0006-1 | |
| Page ruler plus | Thermo Fisher | 26619 | Protein ladder |
| RotiBlock | Roth | A151.1 | Blocking reagent |
| SDS (20%) | Roth | 1057.1 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio Rad | 1852196 | |
| Trans-Blot Turbo | Bio Rad | 1704150EDU | Transfer system |
| Tris base | Roth | 4855.3 | |
| Tween 20 | Roth | 9127.2 | |
| UbcH Enzyme Set | BostonBiochem | K-980B | E2 enzymes |
| Ubiquitin | BostonBiochem | U-100H | |
| Ubiquitin-activating enzyme E1 | Enzo | BML-UW941U-0050 | |
| Ubiquitylation buffer (10x) | Enzo | BML-KW9885-001 | |
| Whatman blotting paper | Bio Rad | 1703969 | Extra thick filter paper |
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