In vitro Analyse de la fonction E3 Ubiquitin Ligase
Summary
La présente étude fournit des protocoles détaillés de dosage d’ubiquitylation in vitro pour l’analyse de l’activité catalytique de l’ubiquitine ligase E3. Les protéines recombinantes ont été exprimées à l’aide de systèmes procaryotes tels que la culture d’Escherichia coli.
Abstract
La fixation covalente de l’ubiquitine (Ub) au(x) résidu(s) interne(s) de lysine d’une protéine de substrat, un processus appelé ubiquitylation, représente l’une des modifications post-traductionnelles les plus importantes chez les organismes eucaryotes. L’ubiquitylation est médiée par une cascade séquentielle de trois classes d’enzymes, notamment les enzymes activatrices de l’ubiquitine (enzymes E1), les enzymes conjuguant l’ubiquitine (enzymes E2) et les ligas d’ubiquitine (enzymes E3), et parfois les facteurs d’allongement de la chaîne ubiquitine (enzymes E4). Ici, des protocoles in vitro pour les tests d’ubiquitylation sont fournis, qui permettent l’évaluation de l’activité de l’ubiquitine ligase E3, la coopération entre les paires E2-E3 et la sélection du substrat. Les paires E2-E3 coopérantes peuvent être examinées en surveillant la génération de chaînes de poly-ubiquitine libres et/ou l’auto-ubiquitylation de la ligase E3. L’ubiquitylation du substrat est définie par liaison sélective de la ligase E3 et peut être détectée par transfert occidental de la réaction in vitro. En outre, un test de décharge E2 ~ Ub est décrit, ce qui est un outil utile pour l’évaluation directe de la coopération fonctionnelle E2-E3. Ici, le transfert dépendant de l’E3 de l’ubiquitine est suivi de l’enzyme E2 correspondante sur des acides aminés lysine libres (imitant l’ubiquitylation du substrat) ou des lysines internes de la ligase E3 elle-même (auto-ubiquitylation). En conclusion, trois protocoles in vitro différents sont fournis qui sont rapides et faciles à réaliser pour traiter la fonctionnalité catalytique de la ligase E3.
Introduction
L’ubiquitylation est le processus par lequel Ub est lié de manière covalente à une protéine de substrat1. La modification Ub est catalysée par des réactions enzymatiques successives impliquant l’action de trois classes d’enzymesdifférentes, à savoir les enzymes activatrices Ub (E1s), les enzymes conjuguantes Ub (E2s), les ligas Ub (E3s), et éventuellement les facteurs d’allongement de la chaîne Ub (E4s)2,3,4,5. Après l’activation de l’Ub dépendant de l’adénosine triphosphate (ATP) et du magnésium (Mg2+),le site actif cystéine d’E1 attaque la glycine C-terminale d’Ub, formant un complexe thioester (Ub ~E1). L’énergie tirée de l’hydrolyse de l’ATP permet à l’Ub d’atteindre un état de transition à haute énergie, qui est maintenu tout au long de la cascade enzymatique suivante. Ensuite, l’enzyme E2 transfère l’Ub activé à sa cystéine catalytique interne, formant ainsi une liaison transitoire Ub ~ E2 thioester. Par la suite, Ub est transféré à la protéine de substrat.
Cela peut être fait de deux manières. Soit la ligase E3 peut d’abord se lier à E2, soit la ligase E3 peut se lier directement à Ub. Cette dernière méthode aboutit à la formation d’un intermédiaire E3 ~ Ub. Dans les deux cas, Ub est lié à la protéine du substrat par la formation d’une liaison isopeptide entre le groupe carboxyle C-terminal d’Ub et le groupe lysine Ɛ-amino du substrat6. Le génome humain code deux E1, environ 40 E2, et plus de 600 ligases putatives d’ubiquitine7. Sur la base du mécanisme de transfert Ub de l’E3, les ligas Ub sont divisées en trois catégories impliquant le type Homologue au type E6AP C-Terminus (HECT), le type Really Interesting New Gene (RING) / U-box et le RING entre les ligas de type RING (RBR)8. Dans cette étude, la boîte en U contenant de la ligase, Carboxyl Terminus de la protéine en interaction HSC70 (CHIP), est utilisée comme enzyme E3 représentative. Contrairement aux enzymes E3 de type HECT qui forment des thioesters Ub ~ E3, le domaine U-box de CHIP lie E2 ~ Ub et favorise le transfert ultérieur Ub / substrat directement à partir de l’enzyme E28,9. Sur la base de l’importance de la boîte en U pour la fonction enzymatique, un mutant CHIP U-box inactif, CHIP (H260Q), est utilisé comme contrôle. CHIP(H260Q) ne parvient pas à se lier à ses E2 apparentés, perdant ainsi son activité de ligase E310.
L’ubiquitylation des protéines joue un rôle crucial dans la régulation d’une multitude d’événements cellulaires dans les cellules eucaryotes. La diversité des résultats cellulaires favorisés par l’attachement réversible des molécules Ub aux protéines du substrat peut être attribuée aux caractéristiques moléculaires de l’Ub. Comme Ub lui-même contient sept résidus de lysine (K) pour une ubiquitylation ultérieure, il existe une riche variété de types de chaînes Ub de tailles et/ou de topologies différentes11. Par exemple, les substrats peuvent être modifiés par une seule molécule Ub à une (mono-ubiquitylation) ou plusieurs lysines (multi mono-ubiquitylation), et même par des chaînes Ub (poly-ubiquitylation)11. Les chaînes Ub sont formées homo- ou heterotypiquement via les mêmes ou différents résidus de lysine d’Ub, ce qui pourrait même entraîner des chaînes Ub ramifiées9. Ainsi, l’ubiquitylation des protéines conduit à divers arrangements de molécules Ub qui fournissent des informations spécifiques, par exemple,pour la dégradation, l’activation ou la localisation des protéines conjuguées12,13. Ces différents signaux Ub permettent une reprogrammation rapide des voies de signalisation cellulaire, ce qui est une exigence importante pour la capacité de la cellule à répondre aux besoins environnementaux changeants.
Un aspect central de l’ubiquitylation est lié au contrôle de la qualité des protéines. Les protéines mal repliées ou irréversiblement endommagées doivent être dégradées et remplacées par des protéines nouvellement synthétisées pour maintenir l’homéostasie ou la protéostasie des protéines14. Le contrôle qualité E3 ligase, CHIP, collabore avec des chaperons moléculaires dans la dégradation Ub-dépendante des protéines endommagées9,15,16,17. En dehors de cela, CHIP régule la stabilité du chaperon dirigé par la myosine, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), qui est étroitement coordonné avec la fonction musculaire et les écarts par rapport aux niveaux optimaux conduisent à une myopathie humaine18,19,20,21. La dégradation de l’UNC-45B par le protéasome 26S est médiée par la fixation d’une chaîne poly-Ub liée au K489. En l’absence de protéines de substrat, CHIP effectue une auto-ubiquitylation10,22,23, qui est caractéristique des ligas d’ubiquitine RING/U-box E324,25 et considérée comme régulant l’activité de la ligase26. L’application des méthodes de dosage d’ubiquitylation in vitro décrites dans cet article a permis d’identifier systématiquement les enzymes E2 qui s’associent à CHIP pour favoriser la formation de chaînes poly-Ub libres et/ou l’auto-ubiquitylation de CHIP (section 2 du protocole). En outre, une ubiquitylation dépendante de CHIP de l’UNC-45B a été observée, qui est un substrat connu de la ligase E318,19 (section 3 du protocole). En fin de compte, le transfert dépendant de CHIP de l’Ub activé à partir du thioester Ub ~ E2 a été surveillé (section 4 du protocole).
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article décrit les méthodes d’ubiquitylation in vitro de base pour l’analyse de la fonction de la ligase E3. Lors de la réalisation de tests d’ubiquitylation in vitro, il convient de considérer que certaines enzymes E2 peuvent effectuer une auto-ubiquitylation en raison de l’attaque de leur cystéine active sur leurs propres résidus de lysine situés à proximité du site actif30. Pour contourner ce problème, l’utilisation d’un mutant E2 est recommandée dan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres de notre laboratoire pour leur discussion critique et leurs conseils utiles sur le manuscrit. Nous nous excusons de ne pas avoir cité de précieuses contributions en raison de la limitation de taille. Ce travail est soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) – SFB 1218 – Projektnumber 269925409 et Cluster of Excellence EXC 229 / CECAD à TH. Ce travail a été financé par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) dans le cadre de la stratégie d’excellence de l’Allemagne – EXC 2030 – 390661388 et – SFB 1218 – Projektnumber 269925409 to T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie – EXC 2030 – 390661388 und – SFB 1218 – Projektnummer: 269925409 an T.H. gefördert.
Materials
| Amershan Protran 0.1 µm NC | GE Healthcare | 10600000 | nitrocellulose membrane |
| Anti-CHIP | Cell Signaling | 2080 | Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6 |
| Anti-MYC | Roche | OP10 | Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10 |
| Anti-ubiquitin | Upstate | 05-944 | Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11 |
| Apyrase | Sigma | A6535-100UN | |
| ATP (10x) | Enzo | 12091903 | |
| BSA | Sigma | A6003-10G | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| KCl | Roth | 6781.1 | |
| K2HPO4 | Roth | P749.2 | |
| KH2PO4 | Roth | 3904.1 | |
| LDS sample buffer (4x) | novex | B0007 | |
| L-Lysine | Sigma | L5501-5G | |
| MES | Roth | 4256.4 | |
| MeOH | VWR Chemicals | 2,08,47,307 | 100% |
| Milchpulver | Roth | T145.3 | |
| NaCl | Roth | P029.3 | |
| NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | |
| NuPAGE Transfer buffer (20x) | novex | NP0006-1 | |
| Page ruler plus | Thermo Fisher | 26619 | Protein ladder |
| RotiBlock | Roth | A151.1 | Blocking reagent |
| SDS (20%) | Roth | 1057.1 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio Rad | 1852196 | |
| Trans-Blot Turbo | Bio Rad | 1704150EDU | Transfer system |
| Tris base | Roth | 4855.3 | |
| Tween 20 | Roth | 9127.2 | |
| UbcH Enzyme Set | BostonBiochem | K-980B | E2 enzymes |
| Ubiquitin | BostonBiochem | U-100H | |
| Ubiquitin-activating enzyme E1 | Enzo | BML-UW941U-0050 | |
| Ubiquitylation buffer (10x) | Enzo | BML-KW9885-001 | |
| Whatman blotting paper | Bio Rad | 1703969 | Extra thick filter paper |
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