Approccio alla perdita di funzione nella retina embrionale del pulcino utilizzando l'espressione transgenica mediata dal trasposone Tol2 di microRNA artificiali
Summary
Abbiamo sviluppato un nuovo approccio di perdita di funzione che prevede l’introduzione e l’integrazione genomica di sequenze di micro-RNA artificiali in embrioni di pulcino utilizzando l’elettroporazione in ovo e il sistema di trasposoni Tol2. Questa tecnica fornisce una metodologia di knockdown genico robusta e stabile per gli studi sulla funzione genica durante lo sviluppo.
Abstract
La retina del pulcino è stata a lungo un importante sistema modello nella neurobiologia dello sviluppo, con vantaggi tra cui le sue grandi dimensioni, il rapido sviluppo e l’accessibilità per la visualizzazione e le manipolazioni sperimentali. Tuttavia, il suo principale limite tecnico era la mancanza di solidi approcci di perdita di funzione per le analisi della funzione genica. Questo protocollo descrive una metodologia di silenziamento genico nella retina del pulcino in via di sviluppo che coinvolge l’espressione transgenica di microRNA artificiali (miRNA) utilizzando il sistema di trasposoni Tol2. In questo approccio, un plasmide trasposone Tol2 che contiene una cassetta di espressione per il marcatore EmGFP (proteina fluorescente verde smeraldo) e sequenze pre-miRNA artificiali contro un gene bersaglio viene introdotto nella retina embrionale del pulcino con un costrutto di espressione della trasposasi Tol2 mediante elettroporazione in ovo . Nelle cellule retiniche trasfettate, la trasposasi catalizza l’escissione della cassetta di espressione dal vettore trasposone e la sua integrazione nei cromosomi dell’ospite, portando all’espressione stabile dei miRNA e della proteina EmGFP. Nel nostro studio precedente, abbiamo dimostrato che l’espressione di Nel, una glicoproteina che esercita molteplici funzioni nello sviluppo neurale, può essere significativamente soppressa nella retina del pulcino in via di sviluppo utilizzando questa tecnica. I nostri risultati indicano che questa metodologia induce una soppressione stabile e robusta dell’espressione genica e quindi fornisce un approccio efficiente alla perdita di funzione per gli studi sullo sviluppo della retina.
Introduction
La retina dei vertebrati è un importante sistema modello per lo studio dello sviluppo neurale. Nonostante la sua posizione periferica, la retina è anatomicamente e dal punto di vista dello sviluppo un’estensione del sistema nervoso centrale e il nervo ottico, costituito da assoni di cellule gangliari retiniche, rappresenta un tratto all’interno del sistema nervoso centrale. La retina del pulcino presenta vantaggi significativi come sistema modello per studiare il meccanismo molecolare dello sviluppo neurale: è grande e si sviluppa rapidamente; presenta somiglianze strutturali e funzionali con la retina umana; È altamente accessibile per la visualizzazione e le manipolazioni sperimentali. I meccanismi molecolari della proliferazione e della differenziazione cellulare, della morfogenesi e della guida degli assoni durante lo sviluppo neurale sono stati ampiamente studiati utilizzando la retina di pollo.
Nell’ovo, l’elettroporazione è stata utilizzata con successo negli ultimi due decenni per introdurre geni ectopici nelle cellule dell’embrione di pulcino in via di sviluppo. Questa tecnica consente la marcatura delle cellule in via di sviluppo, il tracciamento del destino cellulare e il tracciamento della migrazione cellulare e dei tratti assonici, nonché l’espressione genica ectopica per l’analisi in vivo della funzione genica. Le condizioni dell’elettroporazione in ovo per un’efficiente espressione genica ectopica negli embrioni di pulcino sono state ben stabilite 1,2,3.
Nonostante questi vantaggi, la mancanza di una tecnica stabile di perdita di funzione per gli studi sulla funzione genica era stata una delle principali limitazioni tecniche dell’embrione di pulcino. Mentre gli embrioni di pulcino elettropostati con piccoli RNA interferenti (siRNAs)4 o vettori di espressione per RNA a forcina corta (shRNAs)5 mostrano knockdown del gene bersaglio, la soppressione genica in questi approcci è transitoria perché gli effetti scompaiono una volta che le cellule perdono gli RNA o i DNA introdotti. Una soppressione genica più stabile può essere ottenuta somministrando siRNA negli embrioni di pulcino mediante un sistema di retrovirus RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) con un accettore di plice S)6. Il vettore virale si integra nel genoma dell’ospite e i geni ectopici sono espressi in modo stabile. Tuttavia, il retrovirus può integrarsi nel genoma delle cellule in divisione solo durante la fase mitotica (M) del ciclo cellulare, il che può imporre una limitazione agli stadi di sviluppo e/o ai tipi di cellule per i quali questo approccio di perdita di funzione può essere applicato. Inoltre, l’espressione dei transgeni da parte di RCAS appare più lenta e meno robusta di quella indotta dall’elettroporazione in ovo 7.
I trasposoni sono elementi genetici che si spostano da una posizione all’altra del genoma. L’elemento Tol2 è un membro della famiglia degli elementi trasponibili hAT e contiene un gene interno che codifica per una trasposasi che catalizza la reazione del trasposone dell’elemento Tol28. Quando un vettore plasmidico che trasporta una cassetta di espressione genica affiancata dalle sequenze delle estremità sinistra e destra degli elementi Tol2 (200 bp e 150 bp, rispettivamente) viene introdotto in cellule di vertebrati con un costrutto di espressione della trasposasi Tol2, la cassetta di espressione viene asportata dal plasmide e integrata nel genoma dell’ospite, che supporta un’espressione stabile del gene ectopico (Figura 1). È stato dimostrato che l’elemento trasponibile Tol2 può indurre la trasposizione genica in modo molto efficiente in diverse specie di vertebrati, tra cui il pesce zebra9,10, le rane 11, i pulcini12 e i topi 13, ed è quindi un utile metodo di transgenesi e mutagenesi inserzionale. Il sistema di trasposoni Tol2 è stato utilizzato con successo per il knockdown condizionale di un gene bersaglio mediante integrazione genomica di siRNA che viene processato da RNA14 a doppio filamento lungo.
Questo protocollo descrive un approccio di perdita di funzione nell’embrione di pulcino che prevede l’introduzione di microRNA artificiali (miRNA) da parte del sistema di trasposone Tol215,16. In questo approccio, una cassetta di espressione per il marcatore EmGFP (proteina fluorescente verde smeraldo) e miRNA artificiali contro un gene bersaglio viene clonata in un vettore di trasposone Tol2. Il costrutto del trasposone Tol2 viene quindi introdotto nella retina embrionale del pulcino con un costrutto di espressione della trasposasi Tol2 mediante elettroporazione in ovo. Nelle cellule retiniche trasfettate, la trasposasi catalizza l’escissione della cassetta di espressione dal vettore trasposone e la sua integrazione nei cromosomi dell’ospite, portando all’espressione stabile dei miRNA e della proteina EmGFP. Nei nostri studi precedenti, abbiamo abbattuto con successo l’espressione di Nel, una glicoproteina extracellulare espressa prevalentemente nel sistema nervoso, nella retina del pulcino in via di sviluppo (vedi Risultati rappresentativi). I nostri risultati indicano che la soppressione genica stabile ed efficiente può essere ottenuta in ovo con questa tecnica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo fornisce una guida dettagliata al silenziamento genico nella retina del pulcino in via di sviluppo mediante l’espressione transgenica di miRNA artificiali utilizzando l’elettroporazione in ovo e il sistema di trasposone Tol2.
I seguenti fattori sono di fondamentale importanza per eseguire con successo questa tecnica. In primo luogo, è fondamentale utilizzare sequenze di miRNA che hanno dimostrato di esercitare robusti effetti di knockdown. Prima di applicarli per l’…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I vettori pT2K-CAGGS e pCAGGS-T2TP sono stati gentilmente forniti rispettivamente da Yoshiko Takahashi (Università di Kyoto, Kyoto, Giappone) e Koichi Kawakami (Istituto Nazionale di Genetica, Mishima, Giappone). Ringraziamo Michael Berberoglu per la sua lettura cruciale del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Royal Society e del Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (Regno Unito) a M.N.
Materials
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
References
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