Immunfluoreszierende Färbung zur Visualisierung von Heterochromatin-assoziierten Proteinen in Drosophila Speicheldrüsen
Summary
Dieses Protokoll zielt darauf ab, Heterochromatin-Aggregate in Drosophila-Polyten-Zellen zu visualisieren.
Abstract
Die Visualisierung von Heterochromatin-Aggregaten durch Immunfärbung kann eine Herausforderung sein. Viele Säugetierkomponenten von Chromatin sind in Drosophila melanogaster konserviert. Daher ist es ein ausgezeichnetes Modell, um die Bildung und Aufrechterhaltung von Heterochromatin zuuntersuchen. Polytenisierte Zellen, wie sie in Speicheldrüsen von Larven des dritten InstarS D. melanogaster gefunden werden, bieten ein hervorragendes Werkzeug, um das Chromatin fast tausendmal verstärkt zu beobachten, und haben es forschern ermöglicht, Veränderungen in der Verteilung von Heterochromatin im Kern zu untersuchen. Obwohl die Beobachtung von Heterochromatinkomponenten direkt in Polytenchromosompräparaten durchgeführt werden kann, kann die Lokalisation einiger Proteine durch die Schwere der Behandlung verändert werden. Daher ergänzt die direkte Visualisierung von Heterochromatin in Zellen diese Art von Studie. In diesem Protokoll beschreiben wir die für dieses Gewebe verwendeten Immunfärbungstechniken, die Verwendung sekundärer fluoreszierender Antikörper und die konfokale Mikroskopie, um diese Heterochromatinaggregate genauer und detaillierter zu beobachten.
Introduction
Seit den frühen Studien zu Emil Heitz1gilt Heterochromatin als wichtiger Regulator zellulärer Prozesse wie Genexpression, meiotische und mitotische Trennung von Chromosomen und die Aufrechterhaltung der Genomstabilität2,3,4.
Heterochromatin wird hauptsächlich in zwei Typen unterteilt: konstitutives Heterochromatin, das charakteristisch repetitive Sequenzen definiert, und transponierbare Elemente, die an bestimmten Chromosomenstellen wie den Telomeren und Zentromeren vorhanden sind. Diese Art von Heterochromatin wird hauptsächlich epigenetisch durch spezifische Histonmarkierungen wie die Di- oder Trimethylierung von Lysin 9 des Histons H3 (H3K9me3) und die Bindung des Heterochromatinproteins 1a (HP1a)5,6definiert. Auf der anderen Seite lokalisiert fakultatives Heterochromatin durch die Arme des Chromosoms und besteht hauptsächlich aus entwicklungsstillierten Genen7,8. Die Immunfärbung von Heterochromatinblöcken in Metaphasenzellen oder die Beobachtung von Heterochromatinaggregaten in Interphasenzellen hat viel Licht in das Verständnis der Bildung und Funktion heterochromatischer Regionenenthüllt 9.
Die Verwendung von Drosophila als Modellsystem hat die Entwicklung wesentlicher Werkzeuge zur Untersuchung von Heterochromatin ohne den Einsatz von Elektronenmikroskopie ermöglicht10. Seit der Beschreibung der Positionseffektvariegation und der Entdeckung von Heterochromatin-assoziierten Proteinen wie HP1a und histon-posttranslationalen Modifikationen haben viele Gruppen mehrere immunhistochemische Techniken entwickelt, die eine Visualisierung dieser heterochromatischen Regionen ermöglichen10,11.
Diese Techniken basieren auf der Verwendung spezifischer Antikörper, die Heterochromatin-assoziierte Proteine oder Histonmarkierungen erkennen. Für jeden Zelltyp und Antikörper müssen die Fixations- und Permeabilisationsbedingungen empirisch bestimmt werden. Die Bedingungen können auch variieren, wenn zusätzliche mechanische Verfahren wie Quetschtechniken verwendet werden. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung von Drosophila Speicheldrüsen zur Untersuchung heterochromatischer Herde. Speicheldrüsen haben polytenisierte Zellen, die mehr als 1.000 Kopien des Genoms enthalten, so dass eine verstärkte Ansicht der meisten Chromatinmerkmale, mit Ausnahme der Satelliten-DNA und einiger heterochromatischer Regionen, die unterrepliziert sind, möglich ist. Dennoch sind Heterochromatinregionen in Polytenchromosompräparaten leicht sichtbar, aber die Squashing-Techniken können manchmal charakteristische Chromatin-gebundene Komplexe oder die Chromatin-Architektur stören. Daher kann die Immunlokalisierung von Proteinen im gesamten Speicheldrüsengewebe diese unerwünschten Effekte übertreffen. Wir haben dieses Protokoll verwendet, um mehrere Chromatin-gebundene Proteine nachzuweisen, und wir haben gezeigt, dass dieses Protokoll in Kombination mit mutierten Drosophila-Beständen verwendet werden kann, um Heterochromatin-Störung zu untersuchen12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die zelluläre Funktion eukaryotischer Organismen kann die 3D-Struktur innerhalb des Kerns definieren, die durch Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Proteinen mit Chromatin und verschiedenen Molekülen einschließlich RNA unterstützt wird. In den letzten drei Jahren haben die biologischen Kondensate, die relevant waren, einschließlich Heterochromatin, eine grundlegende Rolle bei der Bestimmung der Phasentrennung gespielt, die die ausgeprägte nukleare räumliche Organisation von aktivem und repressivem Chromatin f?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Marco Antonio Rosales Vega und Abel Segura für die Aufnahme einiger der konfokalen Bilder, Carmen Muñoz für die Medienvorbereitung und Dr. Arturo Pimentel, M.C. Andrés Saralegui und Dr. Chris Wood von der LMNA für Ratschläge zur Verwendung der Mikroskope.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen MCT-150-C | 11351904 | brand not critical |
| 16% formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| AF1 Citifluor | Ted pella | 19470 | 25 mL |
| BSA, Molecular Biology Grade | Roche | 10735078001 | brand not critical |
| Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors |
Merck | 5892953001 | |
| Coverslip | Corning | CLS285022-200EA | 22×22, brand not critical |
| DTT | Sigma | d9779 | brand not critical |
| EDTA | Sigma | E5134 | brand not critical |
| EGTA | brand not critical | ||
| Glass slide | Gold seal | 3011 | brand not critical |
| H3BO3 | Baker | 0084-01 | brand not critical |
| H3K9me3 | Abcam | 8889 | |
| HP1a | Hybridoma Bank | C1A9 | Product Form Concentrate 0.1 mL |
| KCl | Baker | 3040-01 | brand not critical |
| Methanol | Baker | 9070-03 | brand not critical |
| NaCl | Sigma | 71376 | brand not critical |
| NaOH | brand not critical | ||
| PIPES | brand not critical | ||
| Rotator | Thermo Scientific | 13-687-12Q | Labquake Tube Shaker |
| Thermo Mixer C | Eppendorf | 13527550 | SmartBlock 1.5 mL |
| Tris | Milipore | 648311 | brand not critical |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | 100 mL, brand not critical |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | 25 mL, brand not critical |
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