פרוטוקול זה נועד לדמיין אגרגטים הטרוקרומטין בתאי טוריטנה Drosophila.
הדמיה של אגרגטים הטרוכרומטינים על ידי חיסון יכול להיות מאתגר. רכיבים יונקים רבים של כרומטין נשמרים Drosophila melanogaster. לכן, זהו מודל מצוין ללמוד היווצרות ותחזוקה הטרוצ’ורומטין. תאים רב-תאיים, כגון אלה שנמצאו בבלוטות הרוק של זחלי אינסטאר D. מלנוגאסטר השלישי, מספקים כלי מצוין להתבוננות בכרומטין מוגבר כמעט אלף פעמים ואפשרו לחוקרים לחקור שינויים בהתפלגות הטרוכרומטין בגרעין. למרות התצפית של רכיבי heterochromatin יכול להתבצע ישירות בתכשירי כרומוזום פוליטן, לוקליזציה של חלבונים מסוימים ניתן לשנות על ידי חומרת הטיפול. לכן, הדמיה ישירה של הטרוקרומטין בתאים משלימה סוג זה של מחקר. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את טכניקות החיסון המשמשות לרקמה זו, את השימוש בנוגדנים פלואורסצנטיים משניים, ומיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לבחון את אגרגטים הטרוקרומטין אלה בדיוק ובפרטים גדולים יותר.
מאז המחקרים המוקדמים של אמיל הייץ1, הטרוכרומטין נחשב רגולטור חשוב של תהליכים תאיים כגון ביטוי גנים, הפרדה מיוטית ומיטוטית של כרומוזומים, ושמירה על יציבות הגנום2,3,4.
הטרוכרומטין מחולק בעיקר לשני סוגים: הטרוקרומטין מהווה המגדיר באופן אופייני רצפים חוזרים ונשנים, ואלמנטים הניתנים לתחלפתם הנמצאים באתרי כרומוזום ספציפיים כגון הטלומרים והצנטרומרים. סוג זה של הטרוכרומטין מוגדר בעיקר באופן אפיגנטי על ידי סימני היסטון ספציפיים כגון di או תלת-מתילציה של ליצין 9 של היסטון H3 (H3K9me3) ואת הכריכה של חלבון Heterochromatin 1a (HP1a)5,6. מצד שני, הטרוצ’ורומטין פקולטיבי ממקם דרך זרועות הכרומוזום ומורכב בעיקר גנים מושתקים התפתחותית7,8. חיסון של בלוקים הטרוצ’ורומטין בתאי metaphase, או תצפית של אגרגטים הטרוצ’ורומטין בתאים בין-פאזיים, חשף הרבה אור בהבנת היווצרות ותפקוד של אזורים הטרכוכרומטיים9.
השימוש Drosophila כמערכת מודל אפשר פיתוח של כלים חיוניים ללמוד הטרוצ’רומטין ללא שימוש במיקרוסקופיה אלקטרונית10. מאז התיאור של שינוי אפקט המיקום וגילוי חלבונים הקשורים להטרוכרומטין, כגון HP1a, ושינויים לאחר תרגום histone, קבוצות רבות פיתחו מספר טכניקות אימונוהיסטוכימיות המאפשרות הדמיה של אזורים הטרכוכרומטיים אלה10,11.
טכניקות אלה מבוססות על שימוש בנוגדנים ספציפיים המזהים חלבונים הקשורים להטרוכרומטין או סימני היסטון. עבור כל סוג תא ונוגדן, יש לקבוע את תנאי הקיבעון והחמלול באופן אמפירי. כמו כן, התנאים עשויים להשתנות אם נעשה שימוש בתהליכים מכניים נוספים כגון טכניקות מעיכה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש בבלוטות הרוק של Drosophila כדי לחקור מוקדים הטרוקרומטיים. בלוטות הרוק יש תאים רביטציה המכילים יותר מ -1,000 עותקים של הגנום, ובכך מספקים תצוגה מוגברת של רוב תכונות הכרומטין, למעט DNA לווין וכמה אזורים הטרכוכרומטיים אשר נמצאים תחת משוכפל. עם זאת, אזורי הטרוכרומטין מוצגים בקלות בתכשירי כרומוזום פוליטן, אך טכניקות העיוץ עלולות לעתים לשבש מתחמים אופייניים הקשורים לכרומטין או את ארכיטקטורת הכרומטין. לכן, אימונולוקלציה של חלבונים ברקמת בלוטת הרוק כולה יכול לעלות על ההשפעות הבלתי רצויות האלה. השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לזהות מספר חלבונים הקשורים לכרומטין, והוכחנו כי פרוטוקול זה בשילוב עם מלאי Drosophila מוטציה יכול לשמש כדי ללמוד הפרעה הטרוקרומטין12.
הפונקציה התאית של אורגניזמים אאוקריוטים יכולה להגדיר את המבנה התלת-ממדי בתוך הגרעין, הנתמך על ידי אינטראקציות בין חלבונים שונים עם כרומטין ומולקולות שונות כולל RNA. בשלוש השנים האחרונות, העיבויים הביולוגיים שיש להם רלוונטיות, כולל הטרוצ’ורומטין, לקחו תפקיד בסיסי בקביעת הפרדת השלבים המקדמ?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים למרקו אנטוניו רוסאלס וגה ואייבל סגורה על שלקחו חלק מהתמונות הקונפוקליות, כרמן מוניוז על ההכנה לתקשורת וד”ר ארתורו פימנטל, מ.C ארנס סרלגי וד”ר כריס ווד מה- LMNA לקבלת ייעוץ על השימוש במיקרוסקופים.
1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen MCT-150-C | 11351904 | brand not critical |
16% formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
AF1 Citifluor | Ted pella | 19470 | 25 mL |
BSA, Molecular Biology Grade | Roche | 10735078001 | brand not critical |
Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors |
Merck | 5892953001 | |
Coverslip | Corning | CLS285022-200EA | 22×22, brand not critical |
DTT | Sigma | d9779 | brand not critical |
EDTA | Sigma | E5134 | brand not critical |
EGTA | brand not critical | ||
Glass slide | Gold seal | 3011 | brand not critical |
H3BO3 | Baker | 0084-01 | brand not critical |
H3K9me3 | Abcam | 8889 | |
HP1a | Hybridoma Bank | C1A9 | Product Form Concentrate 0.1 mL |
KCl | Baker | 3040-01 | brand not critical |
Methanol | Baker | 9070-03 | brand not critical |
NaCl | Sigma | 71376 | brand not critical |
NaOH | brand not critical | ||
PIPES | brand not critical | ||
Rotator | Thermo Scientific | 13-687-12Q | Labquake Tube Shaker |
Thermo Mixer C | Eppendorf | 13527550 | SmartBlock 1.5 mL |
Tris | Milipore | 648311 | brand not critical |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | 100 mL, brand not critical |
β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | 25 mL, brand not critical |