Monitoraggio della crescita dinamica dei vasi retinici in un modello murino di retinopatia indotta da ossigeno

Summary

Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per la preparazione e la colorazione con immunofluorescenza dei supporti piatti retinici dei topi e l’analisi. Anche l’uso della fluorangiografia del fondo oculare (FFA) per i cuccioli di topo e l’elaborazione delle immagini sono descritti in dettaglio.

Abstract

La retinopatia indotta da ossigeno (OIR) è ampiamente utilizzata per studiare la crescita anormale dei vasi nelle malattie ischemiche della retina, tra cui la retinopatia della prematurità (ROP), la retinopatia diabetica proliferativa (PDR) e l’occlusione venosa retinica (RVO). La maggior parte degli studi OIR osserva la neovascolarizzazione retinica in punti temporali specifici; tuttavia, la crescita dinamica dei vasi nei topi vivi lungo un corso temporale, che è essenziale per comprendere le malattie dei vasi correlate all’OIR, è stata poco studiata. Qui, descriviamo un protocollo passo-passo per l’induzione del modello murino OIR, evidenziando le potenziali insidie e fornendo un metodo migliorato per quantificare rapidamente le aree di vaso-obliterazione (VO) e neovascolarizzazione (NV) utilizzando la colorazione con immunofluorescenza. Ancora più importante, abbiamo monitorato la ricrescita dei vasi in topi vivi da P15 a P25 eseguendo l’angiografia del fondo oculare con fluoresceina (FFA) nel modello murino OIR. L’applicazione di FFA al modello murino OIR ci consente di osservare il processo di rimodellamento durante la ricrescita dei vasi.

Introduction

La neovascolarizzazione retinica (RNV), definita come uno stato in cui nuovi vasi patologici hanno origine da vene retiniche esistenti, di solito si estende lungo la superficie interna della retina e cresce nello spazio vitreo (o sottoretinico in alcune condizioni)¹. È un segno distintivo e una caratteristica comune di molte retinopatie ischemiche, tra cui la retinopatia del prematuro (ROP), l’occlusione venosa retinica (RVO) e la retinopatia diabetica proliferativa (PDR)².

Numerose osservazioni cliniche e sperimentali hanno indicato che l’ischemia è la causa principale della neovascolarizzazione retinica ^3,4. Nella ROP, i neonati sono esposti ad ossigeno ad alto livello in incubatori chiusi per aumentare i tassi di sopravvivenza, che è anche un importante fattore per l’arresto della crescita vascolare. Dopo il trattamento, le retine dei neonati sperimentano un periodo relativamente ipossico⁵. Altre situazioni sono osservate nell’occlusione delle vene retiniche centrali o ramificate nella RVO e si osserva anche un danno dei capillari retinici causato dalla microangiopatia nella PDR². L’ipossia aumenta ulteriormente l’espressione di fattori angiogenici come il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) attraverso la via di segnalazione del fattore 1α indotto dall’ipossia (HIF-1α) che a sua volta guida le cellule endoteliali vascolari a crescere nell’area ipossica e formare nuovi vasi ^6,7.

La ROP è una sorta di retinopatia proliferativa vascolare nei neonati pretermine e una delle principali cause di cecità infantile ^8,9, che è caratterizzata da ipossia retinica, neovascolarizzazione retinica e iperplasia fibrosa^10,11,12. Nel 1950, i ricercatori hanno scoperto che un’alta concentrazione di ossigeno può migliorare significativamente i sintomi respiratori dei neonati prematuri^13,14. Di conseguenza, l’ossigenoterapia è stata sempre più utilizzata nei neonati prematuri in quel momento¹⁵. Tuttavia, in concomitanza con l’uso diffuso dell’ossigenoterapia nei neonati pretermine, l’incidenza della ROP è aumentata di anno in anno. Da allora, i ricercatori hanno collegato l’ossigeno alla ROP, esplorando vari modelli animali per comprendere la patogenesi di ROP e RNV¹⁶.

Nell’uomo, la maggior parte dello sviluppo vascolare retinico è completato prima della nascita, mentre nei roditori la vascolarizzazione retinica si sviluppa dopo la nascita, fornendo un sistema modello accessibile per studiare l’angiogenesi nella vascolarizzazione retinica². Con il continuo progresso della ricerca, i modelli di retinopatia indotta da ossigeno (OIR) sono diventati modelli importanti per imitare l’angiogenesi patologica derivante dall’ischemia. Non ci sono specie animali specifiche nello studio del modello OIR e il modello è stato sviluppato in varie specie animali, tra cui gattino 17, ratto¹⁸, topo¹⁹, cucciolo di beagle 20 e zebrafish²¹. Tutti i modelli condividono lo stesso meccanismo con cui sono esposti all’iperossia durante lo sviluppo precoce della retina e poi restituiti all’ambiente normossico. Smith et al. hanno osservato che l’esposizione di cuccioli di topo all’iperossia da P7 per 5 giorni ha indotto una forma estrema di regressione dei vasi nella retina centrale e riportandoli all’aria della stanza a P12 ha gradualmente innescato ciuffi neovascolari, che sono cresciuti verso il corpo vitreo¹⁹. Questo era un modello di topo OIR standardizzato chiamato anche modello di Smith. Connor et al. hanno ulteriormente ottimizzato il protocollo e fornito un metodo universalmente applicabile per quantificare l’area di VO (vaso-obliterazione) e NV (neovascolarizzazione) nel 2009, che ha aumentato l’accettazione e l’utilizzo del modello²². Il modello murino OIR è ancora il modello più utilizzato ora a causa delle sue piccole dimensioni, della riproduzione veloce, del chiaro background genetico, della buona ripetibilità e dell’alto tasso di successo.

Nei topi, la vascolarizzazione retinica inizia dopo la nascita con la crescita dei vasi dalla testa del nervo ottico nella retina interna verso l’ora serrata. Durante il normale sviluppo retinico, i primi vasi retinici spuntano dalla testa del nervo ottico intorno alla nascita, formando una rete in espansione (il plesso primario) che raggiunge la periferia intorno al giorno postnatale 7 (P7) ²³. Quindi i vasi iniziano a crescere nella retina per formare uno strato profondo, penetrare nella retina e stabilire una rete laminare attorno allo strato nucleare interno (INL) come nell’uomo²⁴. Entro la fine della terza settimana postnatale (P21), lo sviluppo del plesso più profondo è quasi completato. Per il modello murino OIR, l’occlusione vascolare appare sempre nella retina centrale a causa della rapida degenerazione di un gran numero di reti vascolari immature nella regione centrale durante l’esposizione all’iperossia. Quindi, la crescita della neovascolarizzazione patologica si verifica anche nella retina medio-periferica, che è il confine dell’area di non perfusione e dell’area vascolare. Tuttavia, i vasi retinici umani si sono quasi formati prima della nascita. Per quanto riguarda i neonati prematuri, la retina periferica non è completamente vascolarizzata quando esposta all’iperossia^25,26. Quindi l’occlusione vascolare e la neovascolarizzazione compaiono principalmente nella retina periferica^27,28. Nonostante queste differenze, il modello OIR murino ricapitola da vicino gli eventi patologici che si verificano durante la neovascolarizzazione indotta da ischemia.

L’induzione del modello OIR può essere suddivisa in due fasi²⁹: nella fase 1 (fase iperoxia), lo sviluppo vascolare retinico viene arrestato o ritardato con occlusione e regressione dei vasi sanguigni a seguito del declino del VEGF e dell’apoptosi delle cellule endoteliali ^24,30; Nella fase 2 (fase ipossia), l’apporto di ossigeno retinico diventerà insufficiente in condizioni di aria ambiente²⁹, che è essenziale per lo sviluppo neurale e l’omeostasi ^19,31. Questa situazione ischemica di solito si traduce in neovascolarizzazione anomala non regolata.

Attualmente, il metodo di modellazione comunemente usato è l’alternanza di esposizione all’ossigeno alto/basso: le madri e i loro cuccioli sono esposti al 75% di ossigeno per 5 giorni a P7 seguiti da 5 giorni in aria ambiente fino a quando P17 ha dimostrato risultati comparabili²², che è il punto finale dell’induzione del modello murino OIR. (Figura 1). Oltre a simulare la ROP, questa neovascolarizzazione patologica mediata da ischemia può essere utilizzata anche per studiare altre malattie ischemiche della retina. Le principali misurazioni di questo modello includono la quantificazione dell’area di VO e NV, che vengono analizzate da supporti piatti retinici mediante colorazione con immunofluorescenza o perfusione FITC-destrano. Ogni topo può essere studiato solo una volta a causa dell’operazione letale. Allo stato attuale, ci sono pochi metodi per osservare continuamente i cambiamenti dinamici della vascolarizzazione retinica durante il processo di regressione vascolare e angiogenesi patologica³². In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato di induzione del modello OIR, analisi di supporti piatti retinici e un flusso di lavoro di angiografia del fondo oculare (FFA) con fluoresceina sui topi che sarebbe utile per ottenere una comprensione più completa dei cambiamenti dinamici vascolari durante due fasi del modello murino OIR.

Protocol

Tutte le procedure che prevedono l’uso di topi sono state approvate dal comitato etico sperimentale sugli animali del Centro oftalmico di Zhongshan, Sun Yat-sen University, Cina (numero autorizzato: 2020-082) e in conformità con le linee guida approvate del Comitato per la cura e l’uso degli animali del Centro oftalmico di Zhongshan e la dichiarazione dell’Associazione di ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l’uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva. 1. Induzione del modello OIR…

Representative Results

Nel modello murino OIR, il risultato più importante e basilare è la quantificazione dell’area VO e NV. Dopo aver vissuto nell’ambiente iperossia per 5 giorni da P7, la retina centrale dei cuccioli ha mostrato la più grande area di non perfusione. Sotto la stimolazione dell’ipossia in altri 5 giorni, è stata gradualmente prodotta la neovascolarizzazione retinica che ha fluorescenza più intensamente rispetto ai vasi normali circostanti. Dopo P17, il segnale di fluorescenza della neovascolarizzazione patologica è regr…

Discussion

La suscettibilità dei topi all’OIR è influenzata da molti fattori. I cuccioli di diverso background genetico e ceppi non possono essere confrontati. Nei topi albini BALB/c, i vasi ricrescono rapidamente nell’area VO con ciuffi neovascolari significativamente ridotti³⁸, che portano alcune difficoltà alla ricerca. Nei topi C57BL/6, c’è un aumento del danno ai fotorecettori rispetto al ceppo murino BALB/cJ^39,40. Lo stesso vale per diversi…

Materials

1 mL sterile syringe	Solarbio	YA0550	For preparation of retinal flat mounts and intraperitoneal injection
1× Phosphate buffered saline (PBS)	Transgen Biotech	FG701-01	For preparation of retinal flat mounts
2 ml Microcentrifuge Tube	Corning	MCT-200-C	For preparation of retinal flat mounts
48 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates	Corning	3548	For preparation of retinal flat mounts
Adhesive microscope slides	Various		For preparation of retinal flat mounts
Adobe Photoshop CC 2019	Adobe Inc.		For image analysis
Carbon dioxide gas	Various		For sacrifice
Cover slide	Various		For preparation of retinal flat mounts
Curved forceps	World Precision Instruments	14127	For preparation of retinal flat mounts
DAPI staining solution	Abcam	ab228549	For labeling nucleus on retinal flat mounts
Dissecting microscope	Olmpus	SZ61	For preparation of retinal flat mounts
Fluorescein sodium	Sigma-Aldrich	F6377	For in vivo imaging
Fluorescent Microscope	Zeiss	AxioImager.Z2	For acquisition of fluorescence images of retinal flat mounts
Fluoromount-G Mounting media	SouthernBiotech	0100-01	For preparation of retinal flat mounts
Hydroxypropyl Methylcellulose	Maya	89161	For in vivo imaging
Isolectin B4 594 antibody	Invitrogen	I21413	For labeling retinal vasculature on retinal flat mounts
Mice C57/BL6J	GemPharmatech of Jiangsu Province		For OIR model induction
Micro dissecting scissors-straight blade	World Precision Instruments	503242	For preparation of retinal flat mounts
No.4 straight forceps	World Precision Instruments	501978-6	For preparation of retinal flat mounts
Normal donkey serum	Abcam	ab7475	For preparation of retinal flat mounts
O2 sensor	Various		For monitoring the level of O2
OxyCycler	Biospherix	A84XOV	For OIR model induction
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148-1KG	For tissue fixation
Pentobarbital sodium	Various		For anesthesia
Soda lime	Various		For absorbing excess CO2 in the oxygen chamber
SPECTRALIS HRA+OCT	Heidelberg	HC00500002	For in vivo imaging
SPSS Statistics 22.0	IBM		For statistical analysis
Tansference decloring shaker	Kylin-Bell	ZD-2008	For preparation of retinal flat mounts
Tissue culture dish (Low attachment)	Corning	3261-20EA	For preparation of retinal flat mounts
Transfer pipettes	Various		For preparation of retinal flat mounts
Triton X-100	Sigma-Aldrich	SLBW6818	For preparation of retinal flat mounts
Tropicamide	Various		For in vivo imaging
ZEN Imaging Software	ZEISS		For image acquisition and export