Microiniezione di Corn Planthopper, Peregrinus maidis, embrioni per l'editing del genoma CRISPR/Cas9

Summary

Qui sono presenti protocolli per la raccolta e la microiniezione di embrioni precellulari di cavallette di mais allo scopo di modificare il loro genoma tramite l’editing del genoma basato su CRISPR / Cas9 o per l’aggiunta di elementi trasponibili marcati attraverso la trasformazione germinale.

Abstract

La cavalletta di mais, Peregrinus maidis, è un parassita del mais e un vettore di diversi virus del mais. Metodi precedentemente pubblicati descrivono l’innesco dell’interferenza dell’RNA (RNAi) in P. maidis attraverso la microiniezione di RNA a doppio filamento (dsRNA) in ninfe e adulti. Nonostante il potere dell’RNAi, i fenotipi generati attraverso questa tecnica sono transitori e mancano di eredità mendeliana a lungo termine. Pertanto, la cassetta degli attrezzi di P. maidis deve essere ampliata per includere strumenti di genomica funzionale che consentirebbero la produzione di ceppi mutanti stabili, aprendo la porta ai ricercatori per portare nuovi metodi di controllo su questo parassita economicamente importante. Tuttavia, a differenza dei dsRNA utilizzati per l’RNAi, i componenti utilizzati nell’editing del genoma basato su CRISPR / Cas9 e nella trasformazione della linea germinale non attraversano facilmente le membrane cellulari. Di conseguenza, il DNA plasmide, gli RNA e/o le proteine devono essere microiniettati negli embrioni prima che l’embrione si cellularizzi, rendendo i tempi di iniezione un fattore critico per il successo. A tal fine, è stato sviluppato un metodo di deposizione delle uova a base di agarosio per consentire il prelievo di embrioni dalle femmine di P. maidis a intervalli relativamente brevi. Qui vengono forniti protocolli dettagliati per la raccolta e la microiniezione di embrioni precellulari di P. maidis con componenti CRISPR (nucleasi Cas9 che è stata complessata con RNA guida), e vengono presentati i risultati del knockout genico basato su Cas9 di un gene del colore degli occhi di P. maidis, bianco. Sebbene questi protocolli descrivano l’editing del genoma CRISPR / Cas9 in P. maidis, possono anche essere utilizzati per produrre P. maidis transgenico attraverso la trasformazione della linea germinale semplicemente cambiando la composizione della soluzione di iniezione.

Introduction

La cavalletta di mais, Peregrinus maidis, è un parassita economicamente importante del mais ^1,2,3. Causano danni fisici diretti alla pianta, sia mentre si nutrono con il loro apparato boccale penetrante-succhiatore, sia durante la riproduzione quando depongono i loro embrioni direttamente nel tessuto vegetale ^2,4. Nonostante le molteplici vie di danno diretto alle colture, l’impatto maggiore che questi insetti hanno sulla salute delle colture è indiretto, agendo come vettore del virus del mosaico del mais (MMV) e del virus della striscia di mais ^5,6. MMV è in grado di replicarsi nel corpo del suo vettore P. maidis, consentendo al virus di persistere nei singoli insetti per tutta la loro vita, in modo che possano continuare a diffondere il virus a nuove piante ospiti ^7,8. I metodi più comuni per controllare P. maidis, e quindi i virus che veicola, sono insetticidi.

Sfortunatamente, la cattiva gestione di questi prodotti ha causato lo sviluppo di resistenza nel parassita bersaglio e l’inquinamento dell’ambiente⁹. Pertanto, sono necessarie nuove strategie per ridurre le perdite di raccolto da questa combinazione di insetti / virus-parassiti. Lavori precedenti hanno dimostrato che l’interferenza dell’RNA (RNAi) potrebbe essere un metodo di controllo efficace per P. maidis perché sono suscettibili di downregulation nell’espressione genica anche quando ingeriscono RNA a doppio filamento (dsRNA)¹⁰. Tuttavia, il modo più efficace per somministrare dsRNA sul campo sarebbe attraverso le piante di cui si nutrono gli insetti; Quindi, le colture potrebbero ancora essere suscettibili a eventuali virus che gli insetti stanno già trasportando. Con l’avvento dell’editing del genoma CRISPR / Cas9, sono possibili nuove strategie di controllo dei parassiti, tra cui il gene drive^11,12 basato su Cas9^, che potrebbe essere utilizzato per ridurre le dimensioni di una popolazione di parassiti o per sostituire tale popolazione con individui resistenti ai virus che veicolano.

Tuttavia, lo sviluppo e l’implementazione di qualsiasi tipo di sistema gene-drive richiederà lo sviluppo di tecniche transgeniche. Tali metodi non erano necessari per condurre esperimenti di RNAi in P. maidis perché si presume che i dsRNA e/o i siRNA siano in grado di attraversare le membrane cellulari a causa dell’efficienza dell’RNAi in P. maidis^10,13. Questo non è vero per i DNA e/o le proteine impiegate nella transgenesi tradizionale o nell’editing genetico basato su Cas9, entrambi i quali sarebbero un precursore della creazione di insetti portatori di un gene drive. Per realizzare l’editing genetico o altre forme di trasformazione germinale, questi DNA e proteine sono idealmente microiniettati negli embrioni durante la fase di blastoderma sinciziale, prima di quando l’embrione insetto si cellularizza. La tempistica è fondamentale, perché la fase sinciziale è la prima parte dello sviluppo^14,15. Poiché le femmine di P. maidis depongono preferenzialmente le uova nel tessuto vegetale, l’estrazione di quantità sufficienti di embrioni precellulari per microiniezioni può essere laborioso e richiedere molto tempo. Pertanto, sono state sviluppate nuove tecniche per raccogliere e microiniettare rapidamente embrioni di P. maidis prima della cellularizzazione.

Protocol

1. Allevamento a livello di colonia di adulti di P. maidis Piantare un minimo di quattro vasi di mais a settimana per gabbia di allevamento, con 3-4 semi per vaso. Crescere in un ambiente privo di insetti. Quando le piante hanno ~ 5 settimane, posizionare all’interno di una gabbia di 30 cm x 30 cm x 60 cm. Procurarsi una quantità sufficiente di adulti di P. maidis (~500) da un laboratorio di ricerca o in natura, e metterli in una gabbia a prova di insetto con 9-12 piante di mais (3-4 vasi). Mantenere la colonia in un’incubatrice per l’allevamento di insetti a 25 °C (± 1 °C), con almeno il 70% di umidità e un ciclo di luce di 14:10. Per generare una colonia calibrata per l’età, rimuovere tutti gli adulti iniziali dopo quattro giorni di deposizione delle uova e consentire agli embrioni deposti nella gabbia di schiudersi e invecchiare naturalmente. Spostare gli insetti P. maidis di 5 settimane (adulti) in piante di mais fresco per la sottocoltura settimanale raccogliendo con un aspiratore (Figura 1). Quindi, rilasciare gli adulti in una gabbia pulita con piante di mais fresche. Per mantenere una fornitura costante di giovani adulti per scopi sperimentali, preparare nuove gabbie calibrate per l’età ogni settimana. Innaffia i vasi nelle gabbie due volte al giorno. Tagliare periodicamente i gambi, rimuovere il materiale vegetale in decomposizione e sostituirli con vasi di mais freschi secondo necessità.NOTA: Con una corretta manutenzione, una colonia può durare ~ 5 settimane (cioè, abbastanza a lungo da consentire agli embrioni deposti nella gabbia di diventare adulti). 2. Camera di deposizione delle uova a base di agarosio Preparare piatti per la raccolta delle uova (mezzo di deposizione delle uova) versando l’1% p/v di agarosio in acqua in piastre di Petri pulite da 100 x 15 mm. Conservare il terreno di ovideposizione a 4 °C dopo la solidificazione. Preparare una soluzione di saccarosio al 10% con peso corporeo per l’alimentazione degli adulti. Conservare la soluzione di saccarosio a -20 °C per un mese. Crea una camera per contenere gli adulti tagliando un foro sul fondo di una tazza da 1 oz (vedi la tabella dei materiali) e incollando uno schermo sopra il foro per il ricambio d’aria (Figura 2). Tagliare la pellicola di cera di paraffina plastica in quadrati di 5 cm x 5 cm; Metti da parte 2 quadrati per ogni tazza. Raccogli ~ 15 femmine adulte di 1 settimana da una colonia di P. maidis calibrata per età. Per selezionare le femmine, esaminare il lato ventrale dell’addome e cercare l’ovopositore, che è tipicamente più scuro del resto dell’addome (Figura 3). Tenere gli adulti per un massimo di un’ora in un flaconcino conico da 15 ml se si installano più camere di deposizione delle uova. Raffreddare brevemente gli insetti sul ghiaccio prima di sessuare e trasferirli nel contenitore per adulti.NOTA: Questo esame può essere eseguito senza microscopio. Le femmine adulte che hanno avuto il tempo di nutrirsi e accoppiarsi hanno anche in genere addomi più grandi dei maschi adulti e sono più docili; quindi, possono essere più facilmente selezionati da una popolazione in gabbia. Trasferire le femmine in un contenitore per adulti e sigillare la tazza con 1 strato di pellicola di paraffina di plastica allungandola uniformemente 3-4 volte la sua dimensione originale (Figura 4A,B). Applicare 400 μL di soluzione di saccarosio al 10% p/v sulla parte superiore del sigillo del film di paraffina di plastica e aggiungere un secondo strato di pellicola di cera di paraffina plastica, allungando la pellicola di cera di paraffina plastica esattamente come sopra (Figura 4C, D).NOTA: Il sandwich di pellicola di paraffina di plastica allungata pressurizza la soluzione di saccarosio, che è molto importante per l’alimentazione degli adulti, ma non impedirà alle femmine di perforare i loro ovopositori fino in fondo nel mezzo di deposizione delle uova. Posizionare la camera per adulti su un piatto per la raccolta delle uova con il lato della pellicola di paraffina di plastica direttamente sul mezzo di deposizione delle uova e avvolgere l’intera camera di deposizione delle uova con pellicola trasparente senza coprire i fori d’aria, poiché questi sono necessari per il ricambio d’aria (Figura 5). Incubare ogni camera di deposizione delle uova a 25 °C con il 70% di umidità e un ciclo di luce 14:10. Cambiare il sandwich di pellicola di cera di paraffina di plastica e la soluzione di saccarosio al 10% p/v ogni giorno e rimuovere l’acqua che si accumula all’interno della tazza. 3. Raccolta e allineamento degli embrioni in un ambiente ad alta umidità Installare un sistema di microiniezione basato su stereomicroscopio in uno spazio o in una cappa umidificata (cappa umidificata; Figura 6) per garantire che l’ambiente di lavoro raggiunga almeno il 70% di umidità durante tutto il processo di microiniezione. Controllare il terreno di deposizione delle uova per le uova dopo il periodo di deposizione delle uova desiderato. Fallo in una cappa umidificata o in un altro ambiente umido.NOTA: Il periodo di deposizione delle uova tipicamente utilizzato è stato durante la notte, dalle 18:00 alle 10:00, della durata di ~ 16 ore. Se vengono deposte delle uova nell’agarosio, utilizzare una pinza fine per estrarle accuratamente e posizionarle sulla superficie dell’agarosio per mantenerle umide (Figura 7A). Applicare una striscia di nastro biadesivo da 1 mm x 15 mm su un coprislip di 22 x 30 mm (figura 7B). Posizionare il nastro adesivo rivolto verso l’alto sul mezzo di ovideposizione (figura 7C). Raccogli ogni singolo uovo dalla superficie dell’agar e spostalo sul nastro biadesivo usando un pennello sottile. Rimuovere eventuali uova completamente bianche o con colorazione nera su di esse. Le uova sane saranno semitrasparenti. Posizionare le uova a forma di banana su un lato, con l’estremità più grande incollata sul nastro biadesivo (Figura 7D).NOTA: Conservare sempre le uova in un ambiente ad alta umidità, come una piastra di Petri colata con uno strato di agar all’1% sul fondo. 4. Preparazione dei reagenti CRISPR e degli aghi per iniezione Tirare gli aghi al quarzo utilizzando un estrattore di micropipette di tipo Flaming/Brown. Smussare gli aghi di quarzo usando una smussatrice per micropipette. Utilizzare nastro adesivo biadesivo per fissare gli aghi tirati in un contenitore trasparente, come una capsula di Petri, fino al momento dell’uso. Preparare la soluzione per iniezione combinando 0,5 μL di proteina Cas9 (5 μg/μL di soluzione madre) e 0,5 μL di sgRNA (4 μg/μL di soluzione madre; vedere la Tabella dei Materiali) con 1 μL di tampone rosso fenolo in un volume finale di 5 μL. Per precipitare particelle che potrebbero ostruire l’ago, vortice brevemente la soluzione e centrifugare per 3 minuti alla massima velocità. Riempire l’ago per iniezione, avendo cura di lasciare la miscela di iniezione vicino all’estremità affusolata dell’ago. Rimuovere le bolle, se presenti, dalla punta dell’ago. Posizionare con cautela l’ago riempito nel supporto dell’ago e stringere il collare in acciaio inossidabile per tenere saldamente l’ago in posizione durante la microiniezione. Generare un flusso affidabile di soluzione iniettabile dall’ago accarezzando delicatamente la punta smussata con un pennello fine e inumidito, mentre eroga raffiche di pressione dell’aria all’ago con il sistema di iniezione.NOTA: L’ago è pronto per l’iniezione quando la miscela di iniezione può lasciare la punta in piccole quantità. 5. Microiniezione e cura post-iniezione Preparare una piattaforma di microiniezione riempiendo una capsula di Petri pulita da 100 x 15 mm con l’1% di agar per formare uno strato livellato di agar a filo con la parte superiore del piatto. Posizionare un foglietto precedentemente preparato con ~ 25 embrioni sulla piattaforma di agar (Figura 8A).NOTA: Tutte le fasi di iniezione devono essere eseguite all’interno di una cappa umidificata (~70% di umidità). Controllare la pressione di iniezione mettendo la punta dell’ago in una goccia d’acqua e avviando il ciclo di iniezione.NOTA: Una piccola quantità di soluzione iniettabile deve disperdersi nell’acqua se l’impostazione della pressione è corretta (Figura 8B). Inserire l’ago nell’estremità più grande dell’embrione, avvicinandosi dal lato sinistro del vetrino (Figura 8C). Somministrare la soluzione per iniezione nell’uovo ed estrarre rapidamente l’ago. Dopo aver iniettato tutte le uova, posizionare il coprislip sulla superficie di una nuova capsula di agar all’1% e trasferire la capsula in una camera di umidità (Figura 9). 6. Incubazione e schiusa di embrioni Mettere la camera di schiusa in un’incubatrice a 25 °C per 6 giorni. Trasferire gli embrioni sopravvissuti, usando acqua pulita e un pennello fine, in una capsula di Petri di 35 mm x 10 mm con carta da filtro inumidita d’acqua che copre il fondo del piatto. Sigillare la capsula di Petri con pellicola di paraffina di plastica e tenerla a 25 °C per consentire agli embrioni di schiudersi. Iniziare a controllare gli embrioni 6 giorni dopo l’iniezione per la sopravvivenza.NOTA: Le prime ninfe inizieranno a schiudersi intorno al giorno 8. Trasferire le ninfe, usando un pennello fine, in una capsula di Petri contenente ritagli di foglie. Coprire il piatto e sigillare con pellicola di paraffina di plastica. Incubare il piatto sigillato dei piccoli su talee di foglie per 48 h a 25 °C. Trasferisci tutte le ninfe di 2 giorni da un ciclo di iniezioni a una gabbia di allevamento con piante di mais usando un pennello fine. Se le iniezioni con fenotipo visibile vengono recuperate in numero sufficiente, allevarle separatamente per massimizzare il recupero del tratto bersaglio nella generazione successiva. Altrimenti, eseguire l’accoppiamento di massa di tutti gli iniettei.NOTA: Posizionare delicatamente i piccoli nella spirale della pianta di mais per fornire rifugio e garantire la corretta umidità del loro ambiente immediato. Allevare gli insetti nelle condizioni sopra descritte, garantendo temperatura, umidità e trasferimenti regolari alle piante di mais fresco. Screening della progenie per i fenotipi attesi. Collocare gli individui che mostrano il fenotipo desiderato nella propria gabbia per stabilire linee omozigoti.

Representative Results

La camera di deposizione delle uova è stata specificamente progettata per consentire alle femmine di P. maidis di nutrirsi durante l’ovodeposizione in un mezzo protettivo da cui le loro uova potrebbero essere facilmente recuperate. Utilizzando questo metodo, sono state recuperate quantità sufficienti di embrioni precellulari per microiniezione con DNA, RNA e / o proteine. Le femmine adulte di P. maidis di solito depongono le uova all’interno del tessuto fogliare delle piante di mais, il che rende difficile ottenere abbastanza uova in un breve lasso di tempo perché richiede molta dissezione fogliare. L’ambiente artificiale di deposizione delle uova fornisce una soluzione per superare questi problemi. Come mostrato nella Tabella 1, 6.483 uova sono state raccolte da un totale di 645 femmine in 4 settimane. Le femmine di solito iniziano a deporre le uova dopo il giorno 2 e forniscono la maggior parte delle uova dal giorno 4 al giorno 6. L’attività di ovideposizione è rallentata entro il giorno 9. Ogni camera di deposizione delle uova è stata allestita il venerdì e controllata per le uova dalla domenica fino alla domenica successiva. Seguire questo programma ha permesso alla maggior parte delle uova di essere raccolte per microiniezioni durante la settimana lavorativa. La prima applicazione pratica di questo sistema di deposizione delle uova è stata quella di testare l’efficacia del knockout genico mediato da Cas9, usando come bersaglio l’ortologo P. maidis del gene del colore degli occhi, bianco (Pmw). È noto che le mutazioni nel bianco provocano una sostanziale perdita di pigmentazione oculare in altre specie di insetti e il bianco è autonomo dalle cellule, consentendo di rilevare mutazioni in individui iniettati16,17. Per aumentare la possibilità che anche una piccola mutazione possa comportare la perdita di funzione, gli RNA guida sono stati progettati per tagliare all’interno della regione della cassetta di legame ATP, che è necessaria per la funzione bianca16. Gli embrioni di P. maidis sono stati iniettati con il 20% di rosso fenolo (tampone di iniezione), tampone iniettabile con Cas9 ad una concentrazione finale di 800 ng / μL (controllo Cas9), o Cas9 in tampone iniettabile insieme a tre RNA guida aggiunti a una concentrazione di 400 ng / μL ciascuno. La combinazione di tre guide all’interno di un mix di iniezione aveva lo scopo di massimizzare ulteriormente le possibilità di generare mutanti, sia creando una grande delezioni, sia compensando la possibilità che una guida potesse essere inefficace per il taglio. I tassi di sviluppo per ciascun trattamento erano comparabili (Tabella 2), con il 50-60% degli individui iniettati che mostravano segni di sviluppo. Anche i tassi di tratteggio per i controlli buffer e Cas9 erano comparabili; Tuttavia, i tassi di schiusa degli individui che ricevevano il mix di tre guide erano relativamente più bassi. Al momento, non è chiaro se la ridotta sopravvivenza sia il risultato della perdita della funzione bianca o il risultato di conseguenze non intenzionali del mix a tre guide, come gli effetti fuori bersaglio (vedi la sezione di discussione). Tuttavia, nessuno degli individui con completa perdita di pigmentazione oculare (cioè knockout completo) si è schiusa, e nessuno della progenie di individui iniettati aveva gli occhi bianchi. L’efficacia on-target della mutagenesi basata su Cas9 è stata verificata in due modi. In primo luogo, le iniezioni sono state sottoposte a screening per la perdita di pigmentazione oculare. Dei 71 individui iniettati a guida che si sono sviluppati, 23 hanno mostrato un certo grado di perdita di pigmento (Figura 10) e 9 di questi individui si sono schiusi, con un tasso di knockout del ≥32%. Non è stata osservata alcuna perdita di pigmento oculare in entrambi i trattamenti di controllo. In secondo luogo, le mutazioni cromosomiche sono state confermate tramite reazione a catena della polimerasi (PCR)18 e sequenziamento19. Poiché non è stato possibile recuperare una linea mutante, il DNA genomico è stato analizzato da pool di embrioni iniettati con il mix a tre guide o tampone. Il mix di tre guide dovrebbe rimuovere ~ 180 coppie di basi dal locus bianco . Questo può essere visto nei prodotti PCR amplificati dal DNA genomico isolato da individui iniettati, così come i dati di sequenza associati generati da tali prodotti (Figura 11). Questa evidenza combinata indica che gli embrioni sono stati iniettati prima che si verificasse la cellularizzazione. Figura 1: Aspiratore. Un aspiratore efficace può essere assemblato collegando una pompa per vuoto all’aspirazione, tramite tubi di plastica, a un tubo conico di plastica da 15 ml. Circa 0,5 cm devono essere accuratamente rimossi dal fondo del tubo conico. Un batuffolo di cotone deve essere posizionato nel tubo conico, sopra l’apertura del tubo di plastica, per catturare gli adulti di P. maidis mentre vengono raccolti e tenerli fuori dalla pompa del vuoto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 2: Costruzione di contenitori per adulti. (A) Le forniture necessarie (in senso orario dall’alto a sinistra): schermo, pistola per colla a caldo, lama di rasoio, contenitore da 1 oz. (B) Un grande foro dovrebbe essere tagliato sul fondo del contenitore da 1 oz, e un quadrato di schermo è tagliato abbastanza grande da coprire questo foro. (C) Lo schermo viene quindi incollato sul foro usando colla a caldo. (D) Una volta fissata la colla, rimuovere le maglie in eccesso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 3: Sesso degli adulti di P. maidis. Sono mostrati i lati ventrali degli adulti maschi (a sinistra) e femminili (a destra) di P. maidis. L’ovopositore, visibile sopra l’addome femminile, è l’indicatore più chiaro del sesso di un individuo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 4: Sigillatura degli adulti in contenitori . (A) Un quadrato di 5 cm x 5 cm di pellicola di paraffina di plastica. (B) Il film deve essere allungato uniformemente a 3-4 volte la sua dimensione originale. (C) Una volta che gli adulti sono stati messi nel contenitore per adulti, la pellicola stirata deve essere posizionata sopra l’apertura per fissare gli adulti. Una goccia di 400 μL di soluzione di saccarosio al 10% p/v deve quindi essere posizionata sopra il film. (D) Per fornire un’adeguata pressione di alimentazione agli adulti, un secondo quadrato di 5 cm x 5 cm di pellicola di paraffina di plastica deve essere allungato allo stesso modo e posto sopra la goccia di saccarosio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 5: Allestimento di una camera di ovideposizione. (A) Le forniture necessarie (in senso orario dall’alto a sinistra): pellicola trasparente, un contenitore per adulti completato (con adulti) e una capsula di Petri con agarosio all’1% (mezzo di ovideposizione). B) Il contenitore per adulti deve essere posto sull’agarosio con la pellicola di paraffina di plastica/il “sandwich” di saccarosio al 10% posto direttamente sul mezzo di deposizione delle uova. (C) L’involucro di plastica è utilizzato per fissare il contenitore adulto al mezzo di ovideposizione. Ciò impedisce al mezzo di asciugarsi troppo rapidamente. (D) Si deve prestare attenzione per evitare di coprire lo schermo del contenitore per adulti, in modo che il ricambio d’aria possa continuare ancora. E) Diagramma della camera di ovideposizione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 6: Cappa umidificata. Una cappa dotata di un umidificatore è stata installata attorno al cannocchiale di iniezione per ridurre al minimo le correnti d’aria e mantenere l’umidità durante la manipolazione degli embrioni. Le alette possono essere piegate sopra l’ingresso dopo che il lavoratore è sul posto, per aiutare a mantenere i livelli di umidità adeguati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 7: Raccolta di embrioni in preparazione per le iniezioni . (A) Embrioni che sono stati depositati nel mezzo di ovideposizione. Un paio di pinze sottili vengono utilizzate per estrarre embrioni dal mezzo e posizionarli sulla sua superficie. (B) Una striscia stretta di nastro biadesivo da 1 mm x 15 mm su un coprislip di 22 mm x 30 mm. (C) Il foglietto di copertura può essere apposto sul mezzo di ovodeposizione per facilitare il trasferimento degli embrioni dalla superficie del mezzo al nastro sul vetrino di presentazione. (D) Gli embrioni di P. maidis sono a forma di banana, con un’estremità più stretta dell’altra (estremità stretta indicata con punta di freccia rossa; estremità più larga indicata con punta di freccia gialla nell’embrione di esempio). L’estremità larga dell’embrione deve essere posizionata sul nastro. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 8: Iniezione . (A) La piattaforma di iniezione è una capsula di Petri riempita fino all’orlo con l’1% di agar. Il foglietto con una striscia di nastro adesivo contenente gli embrioni deve essere posizionato direttamente sulla superficie della piattaforma di iniezione. (B) La pressione di iniezione deve essere testata prima dell’iniezione degli embrioni mediante “iniezione” di una piccola quantità di soluzione iniettabile in una goccia d’acqua. Questo metodo può anche essere utilizzato in qualsiasi momento durante il processo di iniezione per controllare l’ago per gli zoccoli. (C) Gli embrioni devono essere iniettati inserendo l’ago nell’estremità più grande dell’embrione. La soluzione iniettabile deve essere visibile se l’iniezione ha avuto successo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 9: Cura post-iniezione . (A) Una volta iniettati tutti gli embrioni su un foglietto, il foglietto deve essere posto in una capsula di Petri fresca contenente l’1% di agarosio. (B) La capsula di Petri con il coprislip può quindi essere mantenuta in una camera di umidità (come quella mostrata) fino alla schiusa degli embrioni. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 10: Fenotipo knockout di Pmw . (A) Embrioni knockout di pari età e (B) Pmw knockout, con occhi in via di sviluppo indicati da punte di freccia nere. L’embrione in B è a mosaico, poiché si può vedere una piccola striscia di pigmentazione. (C) Controllo di pari età e (D) cuccioli knockout Pmw , con inserti che mostrano una diversa angolazione sugli occhi. Anche il cucciolo in D è mosaico. Una freccia bianca indica un’area nell’immagine principale che mostra la perdita di pigmentazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Figura 11: Sequenza di knockout Pmw . (A) Modello in scala di mRNA Pmw , marcato con incrementi di 500 bp, con le posizioni dei siti di legame del gRNA indicate: G1, blu; G2, giallo; G3, rosa. Qualsiasi mutazione frame-shift generata a questo punto interromperà la maggior parte del prodotto di traduzione. (B) Contesto genomico dei siti di gRNA, tutti in un esone (testo in grassetto maiuscolo). I siti di associazione guida sono evidenziati con gli stessi colori di A e i PAM sono sottolineati. Span è ~ 300 bp. La traduzione in-frame dell’esone è mostrata sopra, come abbreviazioni di una singola lettera nel testo maiuscolo. Sono contrassegnati due motivi specifici per i trasportatori di pigmenti oculari. Il motivo CDEPT del dominio funzionale Walker B è inscatolato in viola e il motivo IHQP del dominio H-loop è inquadrato in verde. Entrambi i domini sono fondamentali per la funzione del trasportatore ATP. (C) La regione target Pmw è stata amplificata utilizzando due cicli di PCR. Il prodotto di secondo turno è stato esaminato su un gel per la prova di spostamento delle dimensioni dovuto alla rimozione riuscita della regione tra le guide. Corine: L = scala 100 bp; 1 = controllo dell’acqua PCR; 2 = uova iniettate tampone; 3-4 = due serie separate di uova iniettate con miscela a tre guide. Solo gli embrioni che hanno ricevuto la miscela a tre guide hanno prodotto sia la banda WT (freccia rossa) che la banda risultante da un’escissione completa (freccia bianca). (D) Per confermare l’identità della banda inferiore (freccia bianca), questo DNA è stato purificato, clonato e sequenziato. La linea superiore è la sequenza wild-type. Le altre due linee sono sequenze di due cloni. Tre cloni aggiuntivi corrispondevano alla sequenza inferiore. L’evidenziazione blu indica il sito di associazione della Guida 1, mentre l’evidenziazione rosa indica il sito di associazione della Guida 3. In entrambi gli alleli, l’intera regione tra questi due siti guida è stata eliminata. Abbreviazioni: Pmw = Peregrinus maidis gene bianco ; gRNA = RNA guida; PAM = motivo adiacente protospaziatore; ATP = adenosina trifosfato; PCR = reazione a catena della polimerasi; WT = wild-type; KO = knockout. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. Mettere # di tazze # di femmine in ogni tazza # di uova Totale # di uova Giorno 2 Giorno 3 Giorno 4 Giorno 5 Giorno 6 Giorno 7 Giorno 8 Giorno 9 1 10 15 0 26 166 355 530 193 91 37 1398 2 15 15 22 238 489 699 520 379 203 58 2608 3 8 15 0 57 230 190 116 80 34 1 708 4 10 15 0 226 446 519 301 179 24 15 1710 Totale 43 15 23 547 1331 1763 1467 831 352 111 6483 Tabella 1: Raccolte rappresentative di ovociti provenienti dall’ambiente di ovideposizione artificiale. Vengono mostrati i dati di quattro serie di tazze per la raccolta delle uova, con i conteggi delle uova che iniziano il secondo giorno dopo la configurazione e durano fino al nono giorno. Trattamento per iniezione Totale iniettato Totale sviluppato Tratteggio totale Tasso di sviluppo (%) Tasso di tratteggio (%) Buffer 39 20 12 51 31 Cas9 39 24 14 61 36 GRNA Cas9 +Pmw 121 71 28 59 28 Tabella 2: Sopravvivenza e tassi di knockout da iniezioni di 3 diversi mix di iniezione.

Discussion

Qualità della deposizione delle uova e nutrizione
Recentemente, i ricercatori che lavorano con una specie correlata, Nilaparvata lugens, hanno ottenuto le uova che hanno usato per le microiniezioni direttamente dalla foglia, mantenendo le uova iniettate nel tessuto fogliare fino a quando non ne hanno schiuse¹⁷. Mentre questo metodo a base di foglie ha fornito un ambiente più naturale per lo sviluppo embrionale, ha anche aumentato le possibilità di infezioni e danni alle uova durante il processo di rimozione. Il sistema di deposizione artificiale delle uova qui presentato fornisce un ambiente più uniforme e riduce le possibilità di danni alle uova dovuti alla manipolazione. Installando le coppette di deposizione delle uova il venerdì, la maggior parte delle uova ovoposite sono state raccolte durante una tipica settimana lavorativa, a beneficio di coloro che svolgono il lavoro di microiniezione. Un avvertimento a questo metodo, tuttavia, è che la mancanza di nutrienti nella dieta della soluzione di saccarosio al 10% finirà per influenzare la salute degli insetti, e le femmine nelle tazze di solito iniziano a morire dopo soli 10 giorni. Anche la qualità delle uova inizia a diminuire dopo 6 giorni, come evidenziato da un aumento delle uova morte o dall’aspetto malsano. Di conseguenza, è importante essere selettivi delle uova utilizzate per le microiniezioni e non tenere le femmine dopo il giorno 6.

Tasso di sopravvivenza e umidità
Due fattori sembrano essere critici per la sopravvivenza embrionale attraverso il processo di microiniezione. L’aspetto più impegnativo della manipolazione degli embrioni di P. maidis è impedire loro di essiccarsi dopo la rimozione dal mezzo di deposizione delle uova e durante la microiniezione. Poiché le uova sono tipicamente deposte all’interno del tessuto vegetale, mancano di un guscio adeguato per prevenire la disidratazione. Anche nella cappa umidificata intere serie di uova sono andate perse a causa dell’essiccazione. Tuttavia, un’umidità eccessivamente elevata potrebbe anche influenzare le microiniezioni se l’acqua si accumulasse sul nastro biadesivo o sull’oscilloscopio. Sfortunatamente, la disidratazione delle uova di solito non era facile da notare durante il processo di microiniezione e spesso apparivano normali fino a 2 o 3 giorni dopo, quando diventavano completamente trasparenti, senza mostrare segni di sviluppo.

Anche la qualità dell’ago sembra svolgere un ruolo importante nella sopravvivenza. L’ago deve essere smussato per ridurre al minimo danni inutili all’uovo. Quando l’ago è bloccato, l’uso della funzione di pulizia sull’iniettore mentre si accarezza delicatamente la punta dell’ago con un pennello inumidito (vedere il punto 4.7) in genere riporta l’ago a uno stato funzionale. Indipendentemente da ciò, si raccomanda di inserire solo piccole quantità di soluzione iniettabile (~0,25 μL) in ciascun ago e passare a un nuovo ago ogni pochi vetrini (~50-60 uova) per garantire che la qualità dell’ago sia mantenuta durante tutto il processo di iniezione.

Generazione di successo di un fenotipo knockout
Per trasformare con successo le cellule germinali, le microiniezioni embrionali di solito devono essere eseguite il più presto possibile prima della cellularizzazione. A seconda della specie di insetto, la finestra temporale per completare le microiniezioni varia da solo un paio d’ore a un giorno intero^14,15,20. Non è ancora chiaro quando gli embrioni di P. maidis subiscano la cellularizzazione. Il knockout mediato da Cas9 è stato testato su embrioni di 4 ore dopo la deposizione dell’uovo (pel) fino a 16 ore di pel, e i fenotipi attesi sono stati osservati in tutti gli esperimenti, suggerendo che tutte le microiniezioni sono state eseguite all’interno della finestra di precellurizzazione.

L’ortologo P. maidis del gene del colore degli occhi, bianco, è stato selezionato perché ci si aspettava che il fenotipo knockout fosse facile da selezionare nelle iniezioni a causa della sua natura autonoma delle cellule. Infatti, come previsto, sia il mosaico che i knockout totali erano chiaramente identificabili tra gli embrioni che ricevevano la miscela iniettabile contenente Cas9 e RNA guida. Sfortunatamente, nessun iniettato con knockout completo si è schiuso e un accoppiamento di massa di iniettee sopravvissute non è riuscito a generare progenie dagli occhi bianchi. Tuttavia, una linea mutante è stata successivamente generata con successo prendendo di mira un gene diverso (Klobasa et al., in corso). Ciò suggerirebbe che l’incapacità di stabilire una linea mutante bianca è molto probabilmente dovuta a effetti fuori bersaglio (ad esempio, Cas9 che taglia regioni importanti altrove nel genoma) generando una mutazione letale strettamente collegata, o a un ruolo critico imprevisto per il bianco in P. maidis.

I dati fenotipici e molecolari (Figura 8 e Figura 9) affermano che un knockout significativo nel locus bianco è stato creato in un campione di embrioni iniettati, che comporterebbe la perdita totale della funzione genica. Inoltre, mentre le mutazioni in bianco sono vitali in alcune specie, c’è un precedente per la ridotta attività bianca dannosa^21,22. Detto questo, gli effetti fuori bersaglio non possono essere completamente esclusi. La previsione di probabili fuori bersaglio richiede dati accurati sulla sequenza del genoma²³, che lo stato attuale delle risorse genomiche in P. maidis rende impossibile da fare in questo momento. Indipendentemente da ciò, con questi nuovi metodi, testare altri geni bersaglio può essere fatto con sicurezza, anche spostandosi verso una transgenesi più tradizionale nel tentativo di portare nuovi strumenti genetici a questo pernicioso parassita.

Materials

1 oz Containers	Dart	P100N	Adult container for egg-laying setup
15 mL Conical Tubes	Olympus	Genesee 28-103	Serves as collection tube on vacuum aspirator setup
15 mL Conical Tubes	Olympus	Genesee 28-106	For making 10% sucorose solution and for holding adults when chilling before screening
Aspirator	Bioquip	1135A	For handling planthoppers
Vacuum Aspirator	Fischer Technical	LAV-3	Vacuum for aspirating larger numbers of insects
Blue Spectrum LED Lights	Home Depot	GLP24FS/19W/LED	Grow lights for potted corn plants hoppers are feeding on
Cas9	TrueCut Cas9 Protein v2	A36498	Endonuclease for cutting planthopper genes
Clear Vinyl Tubing	Home Depot	3/8 in. I.D. x 1/2 in. O.D. x 10 ft.	Connects collection tube to pump on vacuum aspirator setup
Corn planthoppers	North Carolina State University	N/A	Request from Dr. Anna Whitfield's lab
Cotton balls	Genessee	51-101	Serves as a filter/insect catcher in collection tube on vacuum aspirator setup
Double sided tape	Scotch Double Sided Tape	NA	Holding eggs for microinjection
Early Sunglow corn	Park Seed Company	05093-PK-N	Corn for rearing planthoppers
epTIPS Microloader Tips	Eppendorf	C2554691	Backfilling needle loading tips
Femtojet Microinjection System	Eppendorf	5247	Controls injection pressure (12-20 psi, depending on needle bore size)
Nutri-Fly Drosophila Agar	Genessee	66-103	Substrate for everything except egg-laying dish
Fine forceps	Bioquip	4731	Egg handling
General Purpose LE Agarose	Apex	20-102	Substrate inn egg-laying dish (oviposition medium)
Guide RNA 1 – GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG	Synthego	CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)	RNA guides for targeting planthopper white gene
Guide RNA 2 – UCUGAAAUCACUGGCCAAUA	Synthego	CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)	RNA guides for targeting planthopper white gene
Guide RNA 3 – GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU	Synthego	CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol)	RNA guides for targeting planthopper white gene
Humidifyer	Homedics	UHE-CM45	For providing humidity in humidified hood
Humidity chamber	Billups-Rothenberg	MIC-101	For holding injected embryos until hatching
Insect rearing cages	Bioquip (special order)	Close to 1450 L (has plastic front and mesh fabric sides)	Cage for planthoppers on corn
Laser-based Micropipiette Puller	Sutter Instruments	P-2000/G	For making injection needles / Heat = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160
Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope	Leica	M165 FC	Planthopper screening
Microinjection Scope	Leica	MZ12-5	Microinjection scope outfited with an XY stage
Micromanipulator	Narishige	MN-151	For positioning microinjection needle
Micropipette beveler	Sutter Instruments	FG-BV10-D	For beveling injection needles / Used 'fine' graded plate at 20° angle
Microscope Stage	AmScope	GT100 X-Y Gliding Table	For positioning and moving embryos under microscope
Miniature Paint Brush	Testor #2 8733	Sold in 3 pack 281206	Fine paintbrushes for embryo handling
Needle Holder	Narishige	HI-7	For holding the microinjection needle
Percival Incubator	Percival	I41VLH3C8	Rearing injectees until hatch
Petri Dishes (100 x 15 mm)	VWR	89038-968	Making agar dish for egg-lay
pGEM-T Easy Vector System I cloning kit	Promega	A1360	Cloning Pm white target site
Phenol Red	Sigma	143-78-8	Microinjection buffer
Plain Microscope Slides or coverslip	Fisher Scientific	12-549-3	Hold eggs for microinjection
Plasmid DNA Midi Kit	Zymo	D4200	Purification of injection-ready plasmid DNAs
Plastic paraffin film	Pechiney Plastic Packaging	PM-996	Roll size 4 in. x 125 ft
Plastic wrap	Glad ClingWrap Plastic Wrap	NA	Wrap the entire egg-laying chamber
Primer – PmW CRISPR check F1 – AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA	IDT	25 nmole DNA Oligo	First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene
Primer – PmW CRISPR check R1 – GATTCCTCGCTGTTGGGT	IDT	25 nmole DNA Oligo	First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene
Primer – PmW CRISPR check F3 – TCACAGACCCTGGTGCTAATC	IDT	25 nmole DNA Oligo	Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene
Primer – PmW CRISPR check R3 – GTCCACAATCCACACTTCTGA	IDT	25 nmole DNA Oligo	Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene
Quartz capillaries	Sutter Instruments	QF100-50-10	For making microinjection needles / O.D. 1 mm, I.D. 0.7 mm, 10 cm length
Screen (White Organza Fabric)	Joann Fabrics	16023889	For covering the adult container
Sparkleen	Fisher Scientific	04-320-4	Wash dishes
Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1	To make 10% sucorose solution