マウス間質弁細胞の分離を用いて大動脈弁の石灰化を 研究
Summary
この記事では、2段階コラゲターゼ法によるマウス大動脈弁細胞の単離について説明します。孤立したマウス弁細胞は、この インビトロ 石灰化アッセイのような異なるアッセイを行う場合や、大動脈弁鉱化につながる分子経路を調べるために重要です。
Abstract
大動脈弁細胞の石灰化は大動脈狭窄の特徴であり、弁カスプ線維症に関連している。弁間質細胞(VIC)は、骨芽細胞様細胞への脱分化プログラムの活性化を通じて大動脈狭窄における石灰化プロセスにおいて重要な役割を果たす。マウスVICは大動脈弁細胞の鉱化を駆動するシグナル伝達経路の解明のための良いインビトロツールである。本明細書に記載された方法は、これらの著者によってうまく使用され、新たに単離された細胞を得る方法を説明する。2段階コラゲナーゼ処置を1mg/mLおよび4.5mg/mLで行った。最初のステップは、内皮細胞層を除去し、汚染を避けるために重要です。第2のコラゲナーゼインキュベーションは、組織からプレートへのVICの移行を容易にすることである。また、単離されたマウス弁細胞の表現型特性評価のための免疫蛍光染色法についても議論される。さらに、カルシウム試薬測定手順およびアリザリン赤染色を用いてインビトロで石灰化アッセイを行った。マウスバルブ細胞一次培養の使用は、インビトロで細胞の無機化を阻害する新しい薬理学的標的を試験するために不可欠です。
Introduction
石灰化大動脈弁疾患(CAVD)は、西洋集団において最も一般的な弁膜心疾患であり、1歳の65歳以上の高齢者の2.5%近くに影響を及ぼす。CAVDは600万人以上のアメリカ人に影響を及ぼし、正常な血流を損なうリーフレットの機械的特性の変化に関連している-1,2.現在、疾患の進行を止めたり、ミネラル退縮を活性化したりする薬理学的治療法はない。CAVDを治療するための唯一の有効な治療法は、手術または経カテーテル大動脈弁置換術3による大動脈弁置換術である。したがって、新しい薬理学的標的を特定するためには、バルブの鉱物化につながる分子メカニズムを調査することが不可欠です。実際、非治療大動脈狭窄症は、左心室機能不全および心不全4のようないくつかの有害な結果を有する。
大動脈弁は、線維症、海綿体、心室症と呼ばれる3層から構成され、NICを主な細胞タイプ5として含んでいる。線維症と心室は血管内皮細胞(VEC)5の層で覆われている。VECは、炎症細胞の透過性とパラクリンシグナルを調節します。増加した機械的ストレスは、VECの完全性に影響を及ぼし、大動脈弁の恒常性を乱し、炎症細胞の浸潤につながる6.走査型電子顕微鏡分析は、ヒト石灰化大動脈弁7において破壊された内皮を示した。
石灰化組織の組織学的分析は、骨芽細胞および破骨細胞の存在を明らかにする。さらに、VICの骨形成分化は、インビトロおよびヒト弁組織8の両方で観察された。このプロセスは、主に、ラント関連転写因子2(Runx2)および骨形態形成タンパク質(BMP)8,9によって調整される。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、一次培養のためのマウス弁細胞分離の詳細なプロトコルを紹介する。8週齢のマウスから3つの大動脈弁をプールし、十分な数の細胞を得た。さらに、このプロトコルは、VIC表現型の特性評価と インビトロ 鉱化アッセイを記述する。 この方法は、マチューら7から先に説明したプロトコルから適応した。
大動脈弁の分離の間、細?…
Materials
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
| Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
| Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
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