Isolierung von interstitiellen Klappenzellen der Maus zur Untersuchung der Verkalkung der Aortenklappe in vitro
Summary
Dieser Artikel beschreibt die Isolierung von Aortenklappenzellen der Maus durch ein zweistufiges Kollagenase-Verfahren. Isolierte Mausklappenzellen sind wichtig für die Durchführung verschiedener Assays, wie diesen In-vitro-Verkalkungsassay, und für die Untersuchung der molekularen Wege, die zur Aortenklappenmineralisierung führen.
Abstract
Die Verkalkung von Aortenklappenzellen ist das Kennzeichen der Aortenstenose und ist mit klappenhekrose Fibrose verbunden. Valve Interstitial Cells (VICs) spielen eine wichtige Rolle im Verkalkungsprozess bei Aortenstenosen durch die Aktivierung ihres Dedifferenzierungsprogramms gegenüber osteoblastenähnlichen Zellen. Maus-VICs sind ein gutes In-vitro-Werkzeug zur Aufklärung der Signalwege, die die Mineralisierung der Aortenklappenzelle vorantreiben. Die hier beschriebene Methode, die von diesen Autoren erfolgreich eingesetzt wird, erklärt, wie man frisch isolierte Zellen erhält. Ein zweistufiges Kollagenase-Verfahren wurde mit 1 mg/ml und 4,5 mg/ml durchgeführt. Der erste Schritt ist entscheidend, um die Endothelzellschicht zu entfernen und jegliche Kontamination zu vermeiden. Die zweite Kollagenase-Inkubation soll die Migration von VICs vom Gewebe zur Platte erleichtern. Darüber hinaus wird ein Immunfluoreszenz-Färbeverfahren zur Phänotypcharakterisierung der isolierten Mausklappenzellen diskutiert. Darüber hinaus wurde der Verkalkungsassay in vitro unter Verwendung des Calciumreagenz-Messverfahrens und der Alizarinrotfärbung durchgeführt. Die Verwendung von Mausklappenzellprimialkultur ist unerlässlich, um neue pharmakologische Ziele zur Hemmung der Zellmineralisierung in vitro zu testen.
Introduction
Die verkalkte Aortenklappenerkrankung (CAVD) ist die häufigste Herzklappenerkrankung in der westlichen Bevölkerung und betrifft fast 2,5% der älteren Menschen über 65 Jahre1. CAVD betrifft über sechs Millionen Amerikaner und ist mit Veränderungen der mechanischen Eigenschaften der Blättchen verbunden, die den normalen Blutfluss beeinträchtigen1,2. Derzeit gibt es keine pharmakologische Behandlung, um das Fortschreiten der Krankheit zu stoppen oder die Mineralregression zu aktivieren. Die einzige wirksame Therapie zur Behandlung von CAVD ist der Aortenklappenersatz durch Operation oder der Transkatheter-Aortenklappenersatz3. Es ist daher unerlässlich, die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die zur Klappenmineralisierung führen, um neue pharmakologische Ziele zu identifizieren. In der Tat hat eine nicht behandelte Aortenstenose mehrere nachteilige Folgen wie Funktionsstörungen des linken Ventrikels und Herzinsuffizienz4.
Die Aortenklappe besteht aus drei Schichten, die als Fibrosa, Spongiosa und Ventricularis bekannt sind und VICs als vorherrschenden Zelltyp5enthalten. Die Fibrosa und die Ventricularis sind von einer Schicht vaskulärer Endothelzellen (VECs) bedeckt5. Die VECs regulieren die Durchlässigkeit von Entzündungszellen sowie parakrine Signale. Erhöhte mechanische Belastung kann die Integrität der VECs beeinträchtigen und die Homöostase der Aortenklappe stören, was zu einer entzündlichen Zellinvasion führt6. Rasterelektronenmikroskopische Analysen zeigten gestörtes Endothel in einer menschlichen verkalkten Aortenklappe7.
Histologische Analysen von verkalktem Gewebe zeigen das Vorhandensein von Osteoblasten und Osteoklasten. Weiterhin wurde eine osteogene Differenzierung von VICs sowohl in vitro als auch im menschlichen Klappengewebe beobachtet8. Dieser Prozess wird hauptsächlich durch den Runt-verwandten Transkriptionsfaktor 2 (Runx2) und die knochenmorphogenetischen Proteine (BMPs)8,9orchestriert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll der Isolierung von Mausklappenzellen für die Primärkultur vor. Drei Aortenklappen von 8 Wochen alten Mäusen wurden gepoolt, um eine ausreichende Anzahl von Zellen zu erhalten. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll die Charakterisierung des VIC-Phänotyps und den In-vitro-Mineralisierungsassay. Die Methode wurde aus dem zuvor beschriebenen Protokoll von Mathieu et al.7adaptiert.
Bei der Isolieru…
Materials
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
| Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
| Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
References
- Rostagno, C. Heart valve disease in elderly. World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).
- Stewart, B. F., et al. Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study. Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).
- Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., Généreux, P. Medical treatment of aortic stenosis. Circulation. 134 (22), 1766-1784 (2016).
- Spitzer, E., et al. Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials. Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Simionescu, D. T., Chen, J., Jaeggli, M., Wang, B., Liao, J. Form follows function: advances in trilayered structure replication for aortic heart valve tissue engineering. Journal of Healthcare Engineering. 3 (2), 179-202 (2012).
- Bouchareb, R., et al. Activated platelets promote an osteogenic programme and the progression of calcific aortic valve stenosis. European Heart Journal. 40 (17), 1362-1373 (2019).
- Rutkovskiy, A., et al. Valve interstitial cells: the key to understanding the pathophysiology of heart valve calcification. Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).
- Bosse, Y., Mathieu, P., Pibarot, P. Genomics: the next step to elucidate the etiology of calcific aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 51 (14), 1327-1336 (2008).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Richards, J., et al. Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling. American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).
- Bouchareb, R., et al. Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Janssen, J. W., Helbing, A. R. Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum. European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).
- Ortlepp, J. R., et al. Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis. Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).
