I denne artikel beskrives isoleringen af musaortaklappeceller ved hjælp af en totrins kollagenprocedure. Isolerede museventilceller er vigtige for at udføre forskellige assays, såsom denne in vitro-forkalkningsanalyse, og for at undersøge de molekylære veje, der fører til aortaklappens mineralisering.
Forkalkningen af aortaklappen celler er kendetegnende for aorta stenose og er forbundet med ventil cusp fibrose. Valve interstitial celler (VICs) spiller en vigtig rolle i forkalkningsprocessen i aorta stenose gennem aktivering af deres dedifferentiation program til osteoblast-lignende celler. Mouse VICs er et godt in vitro-værktøj til belysning af de signalveje, der driver mineraliseringen af aortaklappen. Den metode, der er beskrevet heri, og som disse forfattere har anvendt med succes, forklarer, hvordan man får frisk isolerede celler. Der blev udført en totrins kollagenprocedure med 1 mg/mL og 4,5 mg/mL. Det første skridt er afgørende for at fjerne det endotelcellelag og undgå forurening. Den anden kollagen inkubation er at lette migrationen af VICs fra vævet til pladen. Derudover diskuteres en immunfluorescens farvningsprocedure for fænotypekarakterisering af de isolerede museventilceller. Desuden blev forkalkningsanalysen udført in vitro ved hjælp af calciumreagensmålingsproceduren og alizarin rød farvning. Brugen af museventilcelle primærkultur er afgørende for test af nye farmakologiske mål for at hæmme cellemineralisering in vitro.
Forkalket aortaklappen sygdom (CAVD) er den mest udbredte valvular hjertesygdom i vestlige populationer, der påvirker næsten 2,5% af ældre personer over 65 år1. CAVD påvirker over seks millioner amerikanere og er forbundet med ændringer i de mekaniske egenskaber af foldere, der forringer normal blodgennemstrømning1,2. I øjeblikket er der ingen farmakologisk behandling for at stoppe sygdommens progression eller for at aktivere mineralregression. Den eneste effektive behandling til behandling af CAVD er udskiftning af aortaklappen ved operation eller transkatheter aortaklappenudskiftning3. Det er derfor bydende nødvendigt at undersøge de molekylære mekanismer, der fører til ventilmineralisering, for at identificere nye farmakologiske mål. Faktisk har ikke-behandlet aorta stenose flere negative konsekvenser såsom venstre ventrikel dysfunktion og hjertesvigt4.
Aortaklappen består af tre lag kendt som fibrosa, spongiosa og ventriker, der indeholder VIC’er som den fremherskende celletype5. Fibrosaen og ventrikierne er dækket af et lag vaskulære endotelceller (VEC)5. VEC’erne regulerer gennemtrængeligheden af inflammatoriske celler samt parakrinesignaler. Øget mekanisk stress kan påvirke VEC’ernes integritet og forstyrre aortaklappens homøostase, hvilket fører til inflammatorisk celleinvasion6. Scanning af elektronmikroskopianalyser viste forstyrret endotel i en forkalket aortaventil hos mennesker7.
Histologiske analyser af forkalket væv afslører tilstedeværelsen af osteoblaster og osteoklaster. Desuden blev der observeret osteogen differentiering af VIC’er både in vitro og i humant ventilvæv8. Denne proces er hovedsageligt orkestreret af Runt-relaterede transskription faktor 2 (Runx2) og knoglen morfogenetiske proteiner (BMPs)8,9.
Denne artikel præsenterer en detaljeret protokol over museventilcelleisolering til primær kultur. Tre aortaklapper fra 8 uger gamle mus blev samlet for at opnå et tilstrækkeligt antal celler. Derudover beskriver denne protokol karakteriseringen af VIC-fænotype og in vitro mineraliseringsanalysen. Metoden blev tilpasset fra den tidligere beskrevne protokol fra Mathieu et al.7.
Under isolering af aortaklapper skal man sørge for at undgå alle kild…
3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
CD31 | Novusbio | ||
Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
FBS | Gibco 16000044 | ||
Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
Vimentin | abcam |