מאמר זה מתאר את הבידוד של תאי שסתום אבי העורקים עכבר על ידי הליך collagenase דו שלבי. תאי שסתום עכבר מבודדים חשובים לביצוע מבדקים שונים, כגון בדיקה זו של הסתיידות במבחנה, ולחקירת המסלולים המולקולריים המובילים מינרליזציה שסתום אבי העורקים.
הסתיידות של תאי שסתום אבי העורקים הוא סימן ההיכר של היצרות אבי העורקים והוא קשור פיברוזיס סף שסתום. תאים ביניים שסתום (VICs) לשחק תפקיד חשוב בתהליך הסתיידות היצרות אבי העורקים באמצעות ההפעלה של תוכנית הדיפרנציאציה שלהם לתאים דמויי אוסטאובלסט. עכבר VICs הם כלי במבחנה טובה עבור ההבהרה של מסלולי איתות המניעים מינרליזציה של תא שסתום אבי העורקים. השיטה המתוארת כאן, בשימוש מוצלח על ידי מחברים אלה, מסבירה כיצד להשיג תאים מבודדים טריים. הליך קולגנאז דו-שלטי בוצע עם 1 מ”ג/מ”ל ו-4.5 מ”ג/מ”ל. השלב הראשון הוא חיוני כדי להסיר את שכבת התא אנדותל ולהימנע כל זיהום. הדגירה השנייה של קולגנאז היא להקל על נדידת אח”מים מהרקמה לצלחת. בנוסף, נדון הליך הכתמת אימונופלואורסצנטיות לאפיון הפנוטיפ של תאי שסתום העכבר המבודדים. יתר על כן, בדיקת הסתיידות בוצעה במבחנה באמצעות הליך מדידת ריאגנט סידן והכתמה אדומה alizarin. השימוש בתרבית הראשית של תאי שסתום העכבר חיוני לבדיקת מטרות פרמקולוגיות חדשות לעיכוב מינרליזציה של תאים במבחנה.
מחלת שסתום אבי העורקים מסוידת (CAVD) היא מחלת הלב valvular הנפוצה ביותר באוכלוסיות המערביות, המשפיעה על כמעט 2.5% מהקשישים מעל גיל65 . CAVD משפיע על יותר משישה מיליון אמריקאים והוא קשור לשינויים בתכונות המכניות של העלונים הפוגעים בזרימת הדם הרגילה עד1,2. נכון לעכשיו, אין טיפול תרופתי כדי לעצור את התקדמות המחלה או להפעיל רגרסיה מינרלית. הטיפול היעיל היחיד לטיפול CAVD הוא החלפת שסתום אבי העורקים על ידי ניתוח או החלפת שסתום אבי העורקים transcatheter3. לכן חובה לחקור את המנגנונים המולקולריים המובילים מינרליזציה שסתום כדי לזהות מטרות פרמקולוגיות חדשות. אכן, היצרות בוני העורקים שאינה מטופלת יש כמה השלכות שליליות כגון תפקוד לקוי החדר השמאלי ואי ספיקת לב4.
שסתום אבי העורקים מורכב משלוש שכבות המכונות פיברוסה, ספונגיוסה, חדרית, אשר מכילים VICs כמו סוג התא השולט5. הפיברוסה וה חדרית מכוסים בשכבה של תאי אנדותל וסקולריים (VECs)5. VECs לווסת את החדירות של תאים דלקתיים, כמו גם אותות paracrine. מתח מכני מוגבר עשוי להשפיע על שלמות VECs ולהפריע הומאוסטזיס של שסתום אבי העורקים, המוביל לפלישה לתא דלקתי6. סריקת ניתוחי מיקרוסקופיה אלקטרונים הראתה אנדותל משובש בשסתום אבי העורקים מסויד אנושי7.
ניתוחים היסטולוגיים של רקמה מסוידת חושפים את נוכחותם של אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים. יתר על כן, הבחנה אוסטאוגנית של VICs נצפתה הן במבחנה והן ברקמת שסתום אנושי8. תהליך זה מתוזמר בעיקר על ידי גורם שעתוק הקשורים גונט 2 (Runx2) ואת חלבונים מורפוגנטי עצם (BMPs)8,9.
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט של בידוד תא שסתום עכבר עבור התרבות הראשית. שלושה שסתומי אבי העורקים מעכברים בני 8 שבועות אוגדו כדי להשיג מספר מספיק של תאים. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר את האפיון של פנוטיפ VIC ואת in vitro mineralization assay. השיטה הותאמה מהפרוטוקול שתואר קודם לכן מאתיו ואח‘7</…
3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
CD31 | Novusbio | ||
Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
FBS | Gibco 16000044 | ||
Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
Vimentin | abcam |