महाधमनी वाल्व इन विट्रो के कैल्किफिकेशन का अध्ययन करने के लिए माउस इंटरस्टिशियल वाल्व कोशिकाओं का अलगाव
Summary
यह लेख दो चरण की कोलेजनेस प्रक्रिया द्वारा माउस महाधमनी वाल्व कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन करता है। अलग माउस वाल्व कोशिकाओं को इस तरह के इन विट्रो calcification परख के रूप में अलग परख प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण हैं, और महाधमनी वाल्व खनिजीकरण के लिए अग्रणी आणविक रास्ते की जांच के लिए ।
Abstract
महाधमनी वाल्व कोशिकाओं का कैलिफिकेशन महाधमनी स्टेनोसिस की पहचान है और यह वाल्व क्यूस फाइब्रोसिस से जुड़ा हुआ है। वाल्व इंटरस्टिशियल कोशिकाएं (वीआईसी) ऑस्टियोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं के लिए अपने डिफर्टेशन प्रोग्राम की सक्रियता के माध्यम से महाधमनी स्टेनोसिस में कैल्सिफिकेशन प्रक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। माउस VICs महाधमनी वाल्व सेल के खनिजीकरण ड्राइविंग सिग्नलिंग रास्तों की स्पष्टता के लिए एक अच्छा इन विट्रो उपकरण हैं। यहां वर्णित विधि, सफलतापूर्वक इन लेखकों द्वारा इस्तेमाल किया, कैसे हौसले से अलग कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए बताते हैं । 1 मिलीग्राम/एमएल और ४.५ मिलीग्राम/एमएल के साथ दो-स्टेप कोलेजनेस प्रक्रिया का प्रदर्शन किया गया । पहला कदम एंडोथेलियल सेल परत को हटाने और किसी भी प्रदूषण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। दूसरा कोलेजनेस इनक्यूबेशन ऊतक से प्लेट में VICs के प्रवास की सुविधा के लिए है। इसके अलावा, अलग माउस वाल्व कोशिकाओं के फेनोटाइप लक्षण वर्णन के लिए एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रक्रिया पर चर्चा की जाती है। इसके अलावा, कैल्शियम रिएजेंट माप प्रक्रिया और एलिजारिन लाल धुंधला का उपयोग करके विट्रो में कैल्सिफिकेशन परख का प्रदर्शन किया गया था। माउस वाल्व सेल प्राथमिक संस्कृति का उपयोग विट्रो में सेल खनिजीकरण को बाधित करने के लिए नए औषधीय लक्ष्यों के परीक्षण के लिए आवश्यक है।
Introduction
कैल्सीफाइड महाधमनी वाल्व रोग (सीएवीडी) पश्चिमी आबादी में सबसे प्रचलित वाल्वुलर हृदय रोग है, जो1वर्ष की आयु के 65 वर्ष से अधिक के लगभग 2.5% बुजुर्ग व्यक्तियों को प्रभावित करता है। CAVD छह लाख से अधिक अमेरिकियों को प्रभावित करता है और पत्रक है कि सामान्य रक्त प्रवाह ख़राब के यांत्रिक गुणों में परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ है1,2के माध्यम से. वर्तमान में, रोग की प्रगति को रोकने या खनिज प्रतिगमन को सक्रिय करने के लिए कोई औषधीय उपचार नहीं है। सीएवीडी के इलाज के लिए एकमात्र प्रभावी चिकित्सा सर्जरी या ट्रांसकैथेटर महाधमनी वाल्वप्रतिस्थापन 3द्वारा महाधमनी वाल्व प्रतिस्थापन है। इसलिए नए औषधीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए वाल्व खनिजीकरण के लिए अग्रणी आणविक तंत्र की जांच करना अनिवार्य है। दरअसल, गैर-उपचारित महाधमनी स्टेनोसिस के कई प्रतिकूल परिणाम होते हैं जैसे कि लेफ्ट वेंट्रिकल डिसफंक्शन और हार्ट फेलियर4।
महाधमनी वाल्व में तीन परतें होती हैं जिन्हें फाइब्रोसा, स्पोंगिओसा और वेंट्रिकुलरिस के रूप में जाना जाता है, जिसमें प्रमुख सेल टाइप5के रूप में VICs होते हैं। फाइब्रोसा और वेंट्रिकुलरिस को वैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (वीईसी)5की एक परत से ढका जाता है। वीईसी भड़काऊ कोशिकाओं के साथ-साथ पैराक्राइन संकेतों की पारमशीलता को विनियमित करते हैं। यांत्रिक तनाव बढ़ने से वीईसी की अखंडता प्रभावित हो सकती है और महाधमनी वाल्व के होमोस्टिसिस को परेशान कर सकता है, जिससे भड़काऊ सेल आक्रमण6हो सकता है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण ों की स्कैनिंग से मानव कैल्सीफाइड महाधमनी वाल्व7में बाधित एंडोथेलियम दिखाई दिया ।
कैल्सीफाइड टिश्यू के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण से ऑस्टियोब्लास्ट और ऑस्टियोक्लास्ट की मौजूदगी का पता चलता है। इसके अलावा, विट्रो और मानव वाल्व ऊतक8 दोनों में VICs के ऑस्टियोजेनिक भेदभाव देखा गया था। यह प्रक्रिया मुख्य रूप से रूंट से संबंधित ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर 2 (Runx2) और बोन मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन (बीएमपीएस)8, 9द्वारा करवायाजाताहै।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह लेख प्राथमिक संस्कृति के लिए माउस वाल्व सेल अलगाव का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। 8 सप्ताह पुराने चूहों से तीन महाधमनी वाल्व कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या में प्राप्त करने के लिए जमा किय…
Materials
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
| Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
| Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
References
- Rostagno, C. Heart valve disease in elderly. World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).
- Stewart, B. F., et al. Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study. Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).
- Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., Généreux, P. Medical treatment of aortic stenosis. Circulation. 134 (22), 1766-1784 (2016).
- Spitzer, E., et al. Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials. Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Simionescu, D. T., Chen, J., Jaeggli, M., Wang, B., Liao, J. Form follows function: advances in trilayered structure replication for aortic heart valve tissue engineering. Journal of Healthcare Engineering. 3 (2), 179-202 (2012).
- Bouchareb, R., et al. Activated platelets promote an osteogenic programme and the progression of calcific aortic valve stenosis. European Heart Journal. 40 (17), 1362-1373 (2019).
- Rutkovskiy, A., et al. Valve interstitial cells: the key to understanding the pathophysiology of heart valve calcification. Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).
- Bosse, Y., Mathieu, P., Pibarot, P. Genomics: the next step to elucidate the etiology of calcific aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 51 (14), 1327-1336 (2008).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Richards, J., et al. Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling. American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).
- Bouchareb, R., et al. Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Janssen, J. W., Helbing, A. R. Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum. European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).
- Ortlepp, J. R., et al. Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis. Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).
