Isolamento delle celle della valvola interstiziale del topo per studiare la calcificazione della valvola aortica in vitro
Summary
Questo articolo descrive l’isolamento delle cellule della valvola aortica del topo con una procedura in due fase di collagenasi. Le cellule isolate della valvola del topo sono importanti per eseguire diversi saggi, come questo saggio di calcificazione in vitro, e per studiare le vie molecolari che portano alla mineralizzazione della valvola aortica.
Abstract
La calcificazione delle cellule della valvola aortica è il segno distintivo della stenosi aortica ed è associata alla fibrosi della cuspide valvolare. Le cellule interstiziali valvolari (CCI) svolgono un ruolo importante nel processo di calcificazione nella stenosi aortica attraverso l’attivazione del loro programma di dedifferenziazione alle cellule simili agli osteoblasti. I VIC del topo sono un buon strumento in vitro per la spiegazione delle vie di segnalazione che guidano la mineralizzazione della cella della valvola aortica. Il metodo descritto nel presente documento, utilizzato con successo da questi autori, spiega come ottenere cellule appena isolate. È stata eseguita una procedura in due fase di collagenasi con 1 mg/mL e 4,5 mg/mL. Il primo passo è fondamentale per rimuovere lo strato cellulare endoteliale ed evitare qualsiasi contaminazione. La seconda incubazione di collagenasi è facilitare la migrazione dei CCI dal tessuto alla piastra. Inoltre, viene discussa una procedura di colorazione dell’immunofluorescenza per la caratterizzazione del fenotipo delle cellule isolate della valvola del topo. Inoltre, il saggio di calcificazione è stato eseguito in vitro utilizzando la procedura di misurazione del reagente del calcio e la colorazione rossa di alizarina. L’uso della coltura primaria delle celle della valvola del topo è essenziale per testare nuovi obiettivi farmacologici per inibire la mineralizzazione cellulare in vitro.
Introduction
La malattia della valvola aortica calcificata (CAVD) è la malattia cardiaca valvulare più diffusa nelle popolazioni occidentali, che colpisce quasi il 2,5% degli individui anziani di età superiore ai 65anni 1. CAVD colpisce oltre sei milioni di americani ed è associato a cambiamenti nelle proprietà meccaniche dei volantini che compromettono il normale flusso sanguigno1,2. Attualmente, non esiste un trattamento farmacologico per fermare la progressione della malattia o attivare la regressione minerale. L’unica terapia efficace per trattare cavd è la sostituzione della valvola aortica con chirurgia o sostituzione della valvola aortica transcatetere3. È quindi indispensabile studiare i meccanismi molecolari che portano alla mineralizzazione delle valvole per identificare nuovi obiettivi farmacologici. In effetti, la stenosi aortica non trattata ha diverse conseguenze avverse come la disfunzione ventricolare sinistra e l’insufficienzacardiaca 4.
La valvola aortica è costituita da tre strati noti come fibrosa, spongiosa e ventricolare, che contengono VIC come cellula predominante ditipo 5. La fibrosa e il ventricolare sono coperti da uno strato di cellule endoteliali vascolari (CCI)5. I HC regolano la permeabilità delle cellule infiammatorie e dei segnali paracrini. L’aumento dello stress meccanico può influire sull’integrità dei CCI e disturbare l’omeostasi della valvola aortica, portando all’invasione infiammatoria dellecellule 6. Le analisi della microscopia elettronica a scansione hanno mostrato endotelio interrotto in una valvola aortica calcificata umana7.
Le analisi istologiche del tessuto calcificato rivelano la presenza di osteoblasti e osteoclasti. Inoltre, è stata osservata la differenziazione osteogenica dei CCI sia in vitro che nel tessuto valvolareumano 8. Questo processo è orchestrato principalmente dal fattore di trascrizione correlato a Runt 2 (Runx2) e dalle proteine morfogenetiche ossee (BMP)8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato di isolamento delle celle della valvola del mouse per le impostazioni cultura primarie. Tre valvole aortiche di topi di 8 settimane sono state raggruppate per ottenere un numero adeguato di cellule. Inoltre, questo protocollo descrive la caratterizzazione del fenotipo VIC e il saggio di mineralizzazione in vitro . Il metodo è stato adattato dal protocollo precedentemente descritto da Mathieu etal.
Dur…
Materials
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
| Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
| Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
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