시험관 내 대동맥 판막의 석회화를 연구하기 위해 마우스 간막판 세포의 격리
Summary
이 문서에서는 2단계 콜라게나아제 절차에 의한 마우스 대동맥 판막 세포의 분리에 대해 설명합니다. 격리된 마우스 밸브 세포는 체외 석회화 분석과 같은 상이한 분석체를 수행하고 대동맥 판막 광물화로 이어지는 분자 경로를 조사하는 데 중요합니다.
Abstract
대동맥 판막 세포의 석회화는 대동맥 협착증의 특징이며 판막 cusp 섬유증과 관련이 있습니다. 판막 간질 세포(VIC)는 골다브라스트와 같은 세포에 대한 그들의 비차별 프로그램의 활성화를 통해 대동맥 협착증의 석회화 과정에서 중요한 역할을 한다. 마우스 VICs는 대동맥 밸브 셀의 광물화를 구동하는 신호 경로의 용해를 위한 좋은 시험관내 도구입니다. 본 명세서에 기술된 방법은, 이 저자에 의해 성공적으로 이용되고, 새로 고립된 세포를 얻는 방법을 설명합니다. 2 단계 콜라게나아제 절차는 1 mg/mL 및 4.5 mg/mL로 수행되었습니다. 첫 번째 단계는 내피 세포 층을 제거하고 오염을 피하는 것이 중요합니다. 두 번째 콜라게나아제 인큐베이션은 조직에서 플레이트로 의 VICs의 이동을 용이하게 하는 것이다. 또한, 분리된 마우스 밸브 세포의 표현형 특성화를 위한 면역형 염색 절차가 논의된다. 더욱이, 석회화 분석법은 칼슘 시약 측정 절차 및 알리자린 붉은 염색을 사용하여 체외에서 수행되었다. 마우스 밸브 세포 1 차 배양의 사용은 체외에서 세포 광물화를 억제하기 위해 새로운 약리학적 표적을 테스트하는 데 필수적입니다.
Introduction
석회화 대동맥 판막 질환 (CAVD)은 1 세 이상 노인 개인의 거의 2.5 %에 영향을 미치는 서양 인구에서 가장 널리 퍼진 valvular 심장질환입니다. CAVD는 6백만 명 이상의 미국인에게 영향을 미치며 정상적인 혈류를 통해1,2를 손상시키는 전단지의 기계적 특성의 변화와 관련이있습니다. 현재 질병의 진행을 중단하거나 미네랄 회귀를 활성화하는 약리학적 치료법은 없습니다. CAVD를 치료하는 유일한 효과적인 치료법은 수술 또는 경피 대동맥 판막 교체3에의한 대동맥 판막 교체입니다. 따라서 새로운 약리학적 인 표적을 식별하기 위해 밸브 광물화로 이어지는 분자 메커니즘을 조사하는 것이 필수적입니다. 실제로, 비처리 대동맥 협착증은 좌심실 기능 장애 및 심부전 4와 같은 몇몇 불리한 결과를 가지고있습니다.
대동맥 판막은 주성 세포 유형5로VICs를 포함하는 섬유증, 스폰지 오사 및 심실증으로 알려진 3 개의 층으로 구성됩니다. 섬유증 및 심실증은 혈관 내피 세포(VEC)5층으로덮여 있다. VEC는 염증 성 세포의 투과성뿐만 아니라 파라크린 신호를 조절합니다. 증가된 기계적 응력은 VEC의 무결성에 영향을 미치고 대동맥 판막의 항상성을 방해하여 염증성 세포 침입6으로이어질 수 있다. 스캐닝 전자 현미경 분석은 인간 석회화 대동맥 판막7에서중단된 내피엄을 보였다.
석회화 된 조직의 조직학적 분석은 골세포와 골세포의 존재를 드러낸다. 더욱이, VIC의 골성 분화는 체외 및 인간 판막 조직8모두에서 관찰되었다. 이 과정은 주로 Runt 관련 전사 인자 2 (Runx2) 및 뼈 형태 유전학 단백질 (BmPs)8,9에의해 오케스트레이션된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에서는 1차 배양에 대한 마우스 밸브 셀 격리의 상세한 프로토콜을 제시합니다. 8주 된 마우스의 3개의 대동맥 판막은 충분한 수의 세포를 얻기 위하여 풀링되었습니다. 또한, 본 프로토콜은 VIC 표현형및 체외 광물화 분석의 특성화를설명합니다. 이 방법은 이전에 설명된 마티유 등으로부터 이전에 설명된 프로토콜로부터 적용하였다.7.
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Materials
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
| Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
| Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
References
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