Isolamento de células válvulas intersticiais do rato para estudar a calcificação da válvula aórtica in vitro

Summary

Este artigo descreve o isolamento das células da válvula aórtica do rato por um procedimento de colagem de duas etapas. Células de válvulas isoladas do rato são importantes para a realização de diferentes ensaios, como este ensaio de calcificação in vitro, e para investigar as vias moleculares que levam à mineralização da válvula aórtica.

Abstract

A calcificação das células válvulas aórticas é a marca registrada da estenose aórtica e está associada à fibrose da cúmlica da válvula. As células intersticiais da válvula (VICs) desempenham um papel importante no processo de calcificação na estenose aórtica através da ativação de seu programa de desdiferente para células semelhantes a osteoblastos. Os VICs do mouse são uma boa ferramenta in vitro para a elucidação das vias de sinalização que conduzem a mineralização da célula da válvula aórtica. O método aqui descrito, utilizado com sucesso por esses autores, explica como obter células recém-isoladas. Foi realizado um procedimento de colagem em duas etapas com 1 mg/mL e 4,5 mg/mL. O primeiro passo é crucial para remover a camada celular endotelial e evitar qualquer contaminação. A segunda incubação de colagem é facilitar a migração de VICs do tecido para a placa. Além disso, discute-se um procedimento de coloração de imunofluorescência para a caracterização do fenótipo das células da válvula isolada do rato. Além disso, o ensaio de calcificação foi realizado in vitro utilizando-se o procedimento de medição do reagente de cálcio e a coloração vermelha de alizarina. O uso da cultura primária da célula de válvula de camundongos é essencial para testar novos alvos farmacológicos para inibir a mineralização celular in vitro.

Introduction

A doença da válvula aórtica calcificada (CAVD) é a doença cardíaca valvular mais prevalente nas populações ocidentais, afetando quase 2,5% dos idosos com mais de 65 anos de idade¹. Cavd afeta mais de seis milhões de americanos e está associado a mudanças nas propriedades mecânicas dos folhetos que prejudicam o fluxo sanguíneo normal^1,2. Atualmente, não há tratamento farmacológico para impedir a progressão da doença ou ativar a regressão mineral. A única terapia eficaz para tratar cavd é a substituição da válvula aórtica por cirurgia ou substituição da válvula aórtica transcateter³. Por isso, é imprescindível investigar os mecanismos moleculares que levam à mineralização da válvula para identificar novos alvos farmacológicos. De fato, a estenose aórtica não tratada tem várias consequências adversas, como disfunção ventrículo esquerda e insuficiência cardíaca⁴.

A válvula aórtica consiste em três camadas conhecidas como fibrosa, esponiosa e ventricular, que contêm VICs como a célula predominante tipo⁵. A fibrosa e a ventricular são cobertas por uma camada de células endoteliais vasculares (VECs)⁵. Os VECs regulam a permeabilidade das células inflamatórias, bem como os sinais paracrinos. O aumento do estresse mecânico pode afetar a integridade dos VECs e perturbar a homeostase da válvula aórtica, levando à invasão celular inflamatória⁶. As análises de microscopia eletrônica de varredura mostraram endotélio interrompido em uma válvula aórtica calcificada humana⁷.

Análises histológicas do tecido calcificado revelam a presença de osteoblastos e osteoclartos. Além disso, observou-se diferenciação osteogênica dos VICs tanto in vitro quanto no tecido da válvula humana⁸. Este processo é orquestrado principalmente pelo fator de transcrição relacionado ao Runt 2 (Runx2) e pelas proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs)^8,9.

Protocol

NOTA: Todos os procedimentos animais aqui descritos foram aprovados pela Escola de Medicina Icahn no comitê institucional de núcleo e uso do Monte Sinai. 1. Preparação antes do isolamento da célula da válvula de camundongos adultos Limpe e esterilize todos os instrumentos cirúrgicos mostrados na Figura 1A utilizando 70% de v/v de etanol e, posteriormente, autoclavando-os por 30 minutos. limpe o espaço cirúrgico com 70% de etanol. Adici…

Representative Results

Como as válvulas aórticas murinas têm tipicamente 1 mm de diâmetro, pelo menos três válvulas devem ser agrupadas para coletar um milhão de células viáveis para diferentes procedimentos experimentais. As diferentes etapas do processo de isolamento VIC são mostradas na Figura 1 e Figura 2. Como é difícil raspar manualmente o tecido da válvula, é preferível usar o estresse de tesoura criado por vórtice para remover os VECs. De fato, os resultados da…

Discussion

Este artigo apresenta um protocolo detalhado do isolamento celular da válvula do rato para a cultura primária. Três válvulas aórticas de camundongos de 8 semanas foram agrupadas para obter um número adequado de células. Além disso, este protocolo descreve a caracterização do fenótipo VIC e o ensaio de mineralização in vitro. O método foi adaptado do protocolo descrito anteriormente por Mathieu et al.⁷.

Durante o isolamento das válvulas …

Materials

3 mm cutting edge scissors	F.S.T	15000-00
Anti-alpha smooth muscle Actin antibody	abcam
Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate	Cell Signaling	4412
Arsenazo-III reagent set	POINT SCIENTIFIC	C7529-500	a Kit to measure the concentration of calcium
Bonn Scissors	F.S.T	14184-09
Calcium hydroxide	SIGMA -Aldrich 31219	31219
CD31	Novusbio
Collagenase type I  (125 units/mg)	Thermofisher Scientific	17018029
DMEM	Tthermofisher	11965092
Extra fine graefe forceps	F.S.T	11150-10
FBS	Gibco 16000044
Fine forceps	F.S.T Dumont
HCl	SIGMA-ALDRICH	H1758
HEPES 1 M solution	STEMCELLS TECHNOLOGIES
L-Glutamine 100x	Thermofisher Scientific	25030081
Mycozap	Lanza	VZA-2011	Mycoplasma elimination reagent
PBS 10x	SIGMA-ALDRICH
penecillin streptomycin 100x	Thermofisher Scientific	10378016
Sodium Pyruvate 100 mM	Thermofisher Scientific	11360070
Standard pattern forceps	F.S.T	11000-12
Surgical Scissors – Sharp-Blunt	F.S.T	14008-14
Trypsin 0.05%	Thermofisher Scientific	25300054
Vimentin	abcam