Выделение клеток интерстициального клапана мыши для изучения кальцификации аортального клапана in vitro
Summary
В этой статье описывается изоляция клеток аортального клапана мыши с помощью двухэтапной коллагеназы. Изолированные клетки мышиного клапана важны для выполнения различных анализов, таких как этот анализ кальцификации in vitro, и для исследования молекулярных путей, ведущих к минерализации аортального клапана.
Abstract
Кальцификация клеток аортального клапана является отличительной чертой аортального стеноза и связана с фиброзом клапанного куспида. Клапанные интерстициальные клетки (ВИК) играют важную роль в процессе кальцификации при стенозе аорты путем активации их программы дедифференциации к остеобластоподобным клеткам. Мышиные ВИК являются хорошим инструментом in vitro для выяснения сигнальных путей, приводящих к минерализации клетки аортального клапана. Способ, описанный в настоящем описании, успешно используемый этими авторами, объясняет, как получить свежеизолированные клетки. Двухэтапная процедура коллагеназы проводилась с 1 мг/мл и 4,5 мг/мл. Первый шаг имеет решающее значение для удаления слоя эндотелиальных клеток и предотвращения любого загрязнения. Вторая инкубация коллагеназы предназначена для облегчения миграции ВИК из ткани в пластину. Кроме того, обсуждается процедура иммунофлуоресцентного окрашивания для фенотипной характеристики изолированных клеток мышиного клапана. Кроме того, анализ кальцификации проводили in vitro с использованием процедуры измерения кальциевого реагента и окрашивания ализарином красным цветом. Использование первичной культуры клеток мышиного клапана имеет важное значение для тестирования новых фармакологических мишеней для ингибирования минерализации клеток in vitro.
Introduction
Кальцинированная болезнь аортального клапана (CAVD) является наиболее распространенным заболеванием клапанного сердца в западных популяциях, затрагивающим почти 2,5% пожилых людей старше 65 лет1года. CAVD поражает более шести миллионов американцев и связан с изменениями механических свойств листочков, которые ухудшают нормальный кровоток –1,2. В настоящее время не существует фармакологического лечения, чтобы остановить прогрессирование заболевания или активировать минеральную регрессию. Единственной эффективной терапией для лечения CAVD является замена аортального клапана хирургическим путем или транскатетерная замена аортального клапана3. Поэтому крайне важно исследовать молекулярные механизмы, ведущие к минерализации клапанов, для выявления новых фармакологических мишеней. Действительно, нелеченный стеноз аорты имеет несколько неблагоприятных последствий, таких как дисфункция левого желудочка и сердечная недостаточность4.
Аортального клапана состоит из трех слоев, известных как фиброза, губчатая и желудочковая, которые содержат ВИК как преобладающий тип клеток5. Фиброза и желудочковые покрыты слоем эндотелиальных клеток сосудов (VEC)5. VEC регулируют проницаемость воспалительных клеток, а также паракринные сигналы. Повышенное механическое напряжение может повлиять на целостность VEC и нарушить гомеостаз аортального клапана, что приводит к воспалительной инвазии клеток6. Анализ сканирующей электронной микроскопии показал нарушение эндотелия в кальцинированном аортального клапане человека7.
Гистологические анализы кальцинированной ткани выявляют наличие остеобластов и остеокластов. Кроме того, остеогенная дифференцировка ВИК наблюдалась как in vitro, так и в ткани клапана человека8. Этот процесс в основном управляется связанным с Runt фактором транскрипции 2 (Runx2) и костными морфогенетическими белками (BMP)8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье представлен подробный протокол изоляции клеток мышиного клапана для первичной культуры. Три аортального клапана у 8-недельных мышей были объединены для получения достаточного количества клеток. Кроме того, этот протокол описывает характеристику фенотипа ВИЦ и анализ ми?…
Materials
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
| Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
| Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
References
- Rostagno, C. Heart valve disease in elderly. World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).
- Stewart, B. F., et al. Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study. Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).
- Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., Généreux, P. Medical treatment of aortic stenosis. Circulation. 134 (22), 1766-1784 (2016).
- Spitzer, E., et al. Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials. Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Simionescu, D. T., Chen, J., Jaeggli, M., Wang, B., Liao, J. Form follows function: advances in trilayered structure replication for aortic heart valve tissue engineering. Journal of Healthcare Engineering. 3 (2), 179-202 (2012).
- Bouchareb, R., et al. Activated platelets promote an osteogenic programme and the progression of calcific aortic valve stenosis. European Heart Journal. 40 (17), 1362-1373 (2019).
- Rutkovskiy, A., et al. Valve interstitial cells: the key to understanding the pathophysiology of heart valve calcification. Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).
- Bosse, Y., Mathieu, P., Pibarot, P. Genomics: the next step to elucidate the etiology of calcific aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 51 (14), 1327-1336 (2008).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
- Richards, J., et al. Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling. American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).
- Bouchareb, R., et al. Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Janssen, J. W., Helbing, A. R. Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum. European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).
- Ortlepp, J. R., et al. Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis. Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).
