Bu makalede, fare aort kapak hücrelerinin iki adımlı bir kollajenaz prosedürü ile izolasyonu açıklanmaktadır. İzole fare valf hücreleri, bu in vitro kireçlenme tahlilleri gibi farklı tahlillerin yapılması ve aort kapak mineralizasyonuna yol açan moleküler yolların araştırılması için önemlidir.
Aort kapak hücrelerinin kireçlenmesi aort darlığı ayırt edici özelliğidir ve kapak cusp fibrozisi ile ilişkilidir. Kapak geçiş hücreleri (VC’ler), aort darlığında kireçlenme sürecinde osteoblast benzeri hücrelere ayırıcı programlarının aktivasyonu ile önemli bir rol oynar. Fare VIC’leri, aort kapak hücresinin mineralizasyonunu yönlendiren sinyal yollarının aydınlatılması için iyi bir in vitro araçtır. Burada açıklanan yöntem, bu yazarlar tarafından başarıyla kullanılan, taze izole hücrelerin nasıl elde edildiğini açıklar. 1 mg/mL ve 4.5 mg/mL ile iki aşamalı kollajenaz işlemi yapıldı. İlk adım, endotel hücre tabakasını çıkarmak ve herhangi bir kirlenmeyi önlemek için çok önemlidir. İkinci kollajenaz inkübasyonu, VC’lerin dokudan plakaya geçişini kolaylaştırmaktır. Ayrıca izole edilmiş fare valf hücrelerinin fenotip karakterizasyonu için bir immünofluoresans boyama prosedürü tartışılmıştır. Ayrıca kalsiyum reaktif ölçüm işlemi ve alizarin kırmızısı lekelenme kullanılarak kireçlenme tahlil in vitro olarak gerçekleştİrilmiştir. Fare kapak hücresi birincil kültürünün kullanımı, hücre mineralizasyon in vitrosunu inhibe etmek için yeni farmakolojik hedeflerin test edilmesi için gereklidir.
Kireçlenmiş aort kapak hastalığı (CAVD), 65 yaş üstü yaşlı bireylerin yaklaşık% 2,5’ini etkileyen batı popülasyonlarında en yaygın valvüler kalphastalığıdır. CAVD altı milyondan fazla Amerikalıyı etkiler ve normal kan akışını bozan broşürlerin mekanik özelliklerindeki değişikliklerle ilişkilidir1,2. Şu anda hastalığın ilerlemesini durdurmak veya mineral gerilemesini aktive etmek için farmakolojik bir tedavi yoktur. CAVD tedavisinde tek etkili tedavi cerrahi veya transktheter aort kapak replasmanı ile aort kapak değişimi3′ dür. Bu nedenle, yeni farmakolojik hedefleri belirlemek için kapak mineralizasyonuna yol açan moleküler mekanizmaların araştırılması zorunludur. Gerçekten de, tedavi edilmeyen aort darlığı sol ventrikül disfonksiyonu ve kalp yetmezliği gibi birkaç olumsuz sonucu vardır4.
Aort kapakçığı fibrosa, spongiosa ve ventrikülaris olarak bilinen ve vic’leri baskın hücre tipi5olarak içeren üç katmandan oluşur. Fibrosa ve ventriküller bir damar endotel hücreleri (VC) tabakası ile kaplıdır5. GC’ler, enflamatuar hücrelerin ve parakrin sinyallerin geçirgenliğini düzenler. Artan mekanik stres, VC’lerin bütünlüğünü etkileyebilir ve aort kapakçığının homeostazını bozabilir ve enflamatuar hücre istilasına yol açabilir6. Taramalı elektron mikroskopi analizleri, insan kireçlenmiş aort kapağında endotelin bozulduğunu göstermiştir7.
Kireçlenmiş dokunun histolojik analizleri osteoblastların ve osteoklastların varlığını ortaya koymaktadır. Ayrıca, VC’lerin osteojenik farklılaşması hem in vitro hem de insan kapak dokusunda gözlenmiştir8. Bu işlem esas olarak Runt ile ilgili transkripsiyon faktörü 2 (Runx2) ve kemik morfogenetik proteinleri (BMP’ler) 8,9tarafından düzenlenir.
Bu makalede, birincil kültür için fare valfi hücre yalıtımının ayrıntılı bir protokolü sunulmaktadır. 8 haftalık farelerden alınan üç aort kapakçığı, yeterli sayıda hücre elde etmek için birikti. Ek olarak, bu protokol VIC fenotipinin karakterizasyonu ve in vitro mineralizasyon testini açıklar. Yöntem, Mathieu ve ark.7‘den daha önce açıklanan protokolden uyarlanmıştır.
Aort kapaklarının izolasyonu sırasında, hücrel…
3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | a Kit to measure the concentration of calcium |
Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
CD31 | Novusbio | ||
Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
DMEM | Tthermofisher | 11965092 | |
Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
FBS | Gibco 16000044 | ||
Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Mycoplasma elimination reagent |
PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
Vimentin | abcam |