Bereiding van ratskeletspieren homogenaten voor nitraat- en nitrietmetingen
Summary
We presenteren protocollen voor drie verschillende methoden voor de homogenisatie van vier verschillende spiergroepen van rattenskeletspierweefsel om de niveaus van nitraat en nitriet te meten en te vergelijken. Verder vergelijken we verschillende monstergewichten om te onderzoeken of de grootte van het weefselmonster de resultaten van homogenisatie beïnvloedt.
Abstract
Nitraationen (NO3–) werden ooit beschouwd als inerte eindproducten van stikstofmonoxide (NO) metabolisme. Eerdere studies toonden echter aan dat nitraationen bij zoogdieren kunnen worden omgezet in NO via een reductiemechanisme in twee stappen: nitraat wordt gereduceerd tot nitriet (NO2–), meestal door orale commensale bacteriën, waarna nitriet wordt gereduceerd tot NO door verschillende mechanismen, waaronder via heem- of molybdeenbevattende eiwitten. Deze reductieve nitraatroute draagt bij aan het verbeteren van NO-gemedieerde signaalroutes, met name in het cardiovasculaire systeem en tijdens spieroefeningen. De niveaus van nitraat in het lichaam vóór een dergelijk gebruik worden bepaald door twee verschillende bronnen: endogene NO-oxidatie en voedingsnitraatinname, voornamelijk van planten. Om de complexe NO-cyclus in fysiologische omstandigheden op te helderen, hebben we de dynamiek van zijn metabolieten, nitraat- en nitritionen, die relatief stabiel zijn in vergelijking met NO, verder onderzocht. In eerdere studies werd skeletspieren geïdentificeerd als een belangrijk opslagorgaan voor nitraationen bij zoogdieren, evenals een directe bron van NO tijdens inspanning. Daarom is het belangrijk om een betrouwbare methodologie vast te stellen voor het meten van nitraat- en nitrietniveaus in skeletspieren en zou het nuttig moeten zijn om de toepassing ervan uit te breiden naar andere weefselmonsters. Dit artikel legt in detail de voorbereiding van skeletspiermonsters uit, met behulp van drie verschillende homogenisatiemethoden, voor nitraat- en nitrietmetingen en bespreekt belangrijke kwesties met betrekking tot homogenisatieprocessen, waaronder de grootte van de monsters. Nitraat- en nitrietconcentraties zijn ook vergeleken in vier verschillende spiergroepen.
Introduction
Stikstofmonoxide (NO), een klein gasvormig signaalmolecuul, speelt een cruciale rol in fysiologische en pathofysiologische processen1. NO kan worden geproduceerd uit L-arginine door endogene enzymen van de stikstofmonoxidesynthase (NOS) familie alvorens een snelle oxidatie tot nitraat (NO3–) en eventueel nitriet (NO2–) in bloed en weefselste ondergaan 2,3. Onlangs is aangetoond dat deze anionen weer zijn teruggebracht tot NO in zoogdiersystemen4. Nitraat wordt omgezet in nitriet, voornamelijk door commensale bacteriële nitraatreductasen in de mondholte die inwerken op ionen die door de speekselklieren worden uitgescheiden en direct worden ingenomen 5, en tot op zekere hoogte door zoogdierenzymen zoals xanthineoxidoreductase 6,7. Nitriet kan verder worden gereduceerd tot NO door verschillende mechanismen, waaronder deoxyhemoglobine8, deoxymyoglobine9, molybdeenbevattende enzymen10 en niet-enzymatische reductie in de aanwezigheid van protonen11,12.
Deze nitraat-nitriet-NO-route wordt versterkt onder hypoxische omstandigheden waarin de NOS-activiteit wordt verminderd omdat NOS zuurstof nodig heeft voor NO-generatie4. Veel recente studies hebben gunstige effecten van voedingsnitraat op bloeddrukregulatie en trainingsprestaties gemeld, wat suggereert dat nitraatreductieroutes bijdragen aan de toename van NO-signalering 13,14,15. Eerdere studies hebben aangetoond dat sommige skeletspieren waarschijnlijk de belangrijkste nitraatopslagplaatsen in het lichaam zijn16. In vergelijking met bloed of andere inwendige organen zoals lever, bevat de skeletspieren (gluteus maximus) significant hogere niveaus van nitraat en hebben ze een aanzienlijke massa in het lichaam van zoogdieren. Loopbandoefeningen bleken de nitraatreductie tot nitriet en tot NO in gluteus te verbeteren in een ratmodel7. Deze resultaten impliceren dat sommige skeletspieren belangrijke bronnen voor NO kunnen zijn via nitraatreductieroutes in fysiologische situaties. Meer recente studies suggereren dat deze bevindingen, inclusief veranderingen in spiernitraatniveaus tijdens inspanning, ook voorkomen bij mensen17.
Twee van de huidige auteurs hadden eerder een methode vastgesteld om het nitraat- en nitrietgehalte in bloed en andere vloeibare monsters te meten18. Toen de niveaus van deze anionen in weefselhomogenaten echter aanvankelijk werden geanalyseerd, waren er geen gedetailleerde protocollen beschikbaar. Om de nitraat-nitriet-NO-dynamiek in verschillende organen te begrijpen, was ons doel om een nauwkeurige en efficiënte methode te ontwikkelen om nitraat- en nitrietniveaus in zoogdierweefsels, waaronder skeletspieren, te meten. In eerdere studies werden knaagdierweefsels gebruikt om betrouwbare homogenisatieprocessen te ontwikkelen en vervolgens het nitraat- en nitrietgehalte in die homogenatente analyseren 7,16,19. Het gebruik van deze homogenisatiemethode werd uitgebreid tot menselijke skeletspierbiopsiemonsters, waarbij de waarden werden bevestigd, en belangrijker nog, de waargenomen waarden voor spieren in vergelijking met bloed / plasma waren in vergelijkbare bereiken en verhoudingen als die waargenomen bij knaagdieren17. In de afgelopen jaren zijn andere groepen ook begonnen met het meten van nitraat- en nitrietniveaus in skeletspierhomogenaten, waarbij vergelijkbare waarden werden gerapporteerd als die gerapporteerd door onze groep20,21.
Het doel van dit protocolartikel is om in detail de bereiding van skeletspierhomogenaten te beschrijven met behulp van drie verschillende homogenisatiemethoden voor latere metingen van nitraat- en nitrietniveaus. Bovendien werden de effecten van weefselgewicht dat wordt gebruikt voor homogenisatie op waarden van nitraat en nitriet in skeletspiermonsters onderzocht. Wij geloven dat deze methoden gemakkelijk kunnen worden toegepast op andere soorten weefsels van zoogdieren. Recent, vooral op het gebied van inspanningsfysiologie, was aandacht besteed aan de mogelijke verschillen in nitraat/nitriet/NO-fysiologie volgens spiergroepen. We rapporteren ook de hoeveelheden nitraat en nitriet in vier verschillende knaagdierspieren en vinden een niet-uniforme verdeling van beide ionen over deze verschillende spieren; een constatering die nader onderzoek vereist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om veranderingen in de NO-metabolieten, nitraat en nitriet te volgen, als functie van fysiologische interventies, is het noodzakelijk om de niveaus van deze ionen in de verschillende organen te meten die cruciaal zijn in hun metabolisme. Omdat hemoglobine in het bloed zal reageren met NO en zijn metabolieten, is het ook belangrijk om bloed zo snel mogelijk uit weefselmonsters te verwijderen. Zo werden dieren doordrenkt met zoutoplossing voordat ze skeletspierweefsels verzamelden (gluteus, TA, EDL, gastrocnemiusspier) en …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door intramurale NIH/NIDDK subsidie ZIA DK 0251041-14 aan Alan N Schechter, MD.
Materials
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Length: 87 mm; Diameter: 30 mm |
| Heparin Sodium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| Nitric Oxide analyzer | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys lysing kit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization |
| Pulverizer kit | Cellcrusher | Cellcrusher kit |
References
- Ignarro, L. J. Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview. Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), 503-514 (2002).
- Moncada, S., Higgs, A. The L-arginine-nitric oxide pathway. New England Journal of Medicine. 329 (27), 2002-2012 (1993).
- Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
- Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash. Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).
- Jansson, E. A., et al. A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis. Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).
- Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle. Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Shiva, S., et al. Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration. Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).
- Millar, T. M., et al. Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions. FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).
- Benjamin, N., et al. Stomach NO synthesis. Nature. 368 (6471), 502 (1994).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air. Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).
- Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).
- Kapil, V., et al. Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO. Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).
- Jones, A. M. Dietary nitrate supplementation and exercise performance. Sports Medicine. 44, 35-45 (2014).
- Piknova, B., et al. Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir. Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).
- Wylie, L. J., et al. Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise. Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).
- Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay. Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).
- Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. Journal of Visualized Experiments. (118), e54879 (2016).
- Nyakayiru, J., et al. Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans. Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).
- Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC. Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).
- Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).
- Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats. bioRxiv. , (2020).
- Ohtake, K., et al. Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice. Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).
