नाइट्रेट और नाइट्राइट माप के लिए चूहे कंकाल की मांसपेशी होमोजेनेट्स की तैयारी
Summary
हम नाइट्रेट और नाइट्राइट के स्तर को मापने और तुलना करने के लिए चूहे के कंकाल की मांसपेशी ऊतक के चार अलग-अलग मांसपेशी समूहों के समरूपीकरण के लिए तीन अलग-अलग तरीकों के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इसके अलावा, हम यह जांचने के लिए विभिन्न नमूना भार की तुलना करते हैं कि ऊतक नमूना आकार समरूपीकरण के परिणामों को प्रभावित करता है या नहीं।
Abstract
नाइट्रेट आयनों (NO3–) को एक बार नाइट्रिक ऑक्साइड (NO) चयापचय के निष्क्रिय अंत उत्पाद माना जाता था। हालांकि, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि नाइट्रेट आयनों को दो-चरणीय कमी तंत्र के माध्यम से स्तनधारियों में वापस एनओ में परिवर्तित किया जा सकता है: नाइट्रेट को नाइट्राइट (एनओ2–) में ज्यादातर मौखिक कॉमेंसल बैक्टीरिया द्वारा कम किया जाता है, फिर नाइट्राइट को कई तंत्रों द्वारा एनओ में कम किया जाता है, जिसमें हीम- या मोलिब्डेनम युक्त प्रोटीन शामिल हैं। यह रिडक्टिव नाइट्रेट मार्ग एनओ-मध्यस्थता सिग्नलिंग मार्गों को बढ़ाने में योगदान देता है, विशेष रूप से कार्डियोवैस्कुलर सिस्टम में और मांसपेशियों के व्यायाम के दौरान। इस तरह के उपयोग से पहले शरीर में नाइट्रेट का स्तर दो अलग-अलग स्रोतों द्वारा निर्धारित किया जाता है: अंतर्जात एनओ ऑक्सीकरण और आहार नाइट्रेट का सेवन, मुख्य रूप से पौधों से। शारीरिक परिस्थितियों में जटिल एनओ चक्र को स्पष्ट करने के लिए, हमने इसके मेटाबोलाइट्स, नाइट्रेट और नाइट्राइट आयनों की गतिशीलता की जांच की है, जो एनओ की तुलना में अपेक्षाकृत स्थिर हैं। पिछले अध्ययनों में कंकाल की मांसपेशी को स्तनधारियों में नाइट्रेट आयनों के लिए एक प्रमुख भंडारण अंग के रूप में पहचाना गया था, साथ ही व्यायाम के दौरान एनओ का प्रत्यक्ष स्रोत भी था। इसलिए, कंकाल की मांसपेशियों में नाइट्रेट और नाइट्राइट के स्तर को मापने के लिए एक विश्वसनीय पद्धति स्थापित करना महत्वपूर्ण है और अन्य ऊतक नमूनों में इसके आवेदन का विस्तार करने में सहायक होना चाहिए। यह पेपर नाइट्रेट और नाइट्राइट माप के लिए तीन अलग-अलग होमोजेनाइजेशन विधियों का उपयोग करके कंकाल की मांसपेशियों के नमूनों की तैयारी को विस्तार से बताता है और नमूनों के आकार सहित होमोजेनाइजेशन प्रक्रियाओं से संबंधित महत्वपूर्ण मुद्दों पर चर्चा करता है। नाइट्रेट और नाइट्राइट सांद्रता की तुलना चार अलग-अलग मांसपेशी समूहों में भी की गई है।
Introduction
नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ), एक छोटा गैसीय सिग्नलिंग अणु, शारीरिक और पैथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिकानिभाता है। नाइट्रेट (एनओ3-) और संभवतः, रक्तऔर ऊतकों में नाइट्राइट (एनओ 2–) में तेजी से ऑक्सीकरण से गुजरने से पहले नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ (एनओएस) परिवार के अंतर्जातएंजाइमों द्वारा एल-आर्जिनिन से एनओ का उत्पादन किया जा सकता है। हाल ही में, इन आयनों को स्तनधारी प्रणालियों में वापस एनओ में कम दिखाया गयाहै। नाइट्रेट को नाइट्राइट में परिवर्तित किया जाता है, मुख्य रूप से मौखिक गुहा में कोमेंसल बैक्टीरियल नाइट्रेट रिडक्टेस द्वारा लार ग्रंथियों द्वारा स्रावित आयनों पर काम किया जाता है और सीधे 5, और कुछ हद तक, स्तनधारी एंजाइमों जैसे ज़ैंथिन ऑक्सीडोरडक्टेस 6,7 द्वारा निगला जाता है। नाइट्राइट को डीऑक्सीहीमोग्लोबिन8, डीऑक्सीमायोग्लोबिन9, मोलिब्डेनम युक्त एंजाइम 10, और प्रोटॉन11,12 की उपस्थिति में गैर-एंजाइमेटिक कमी सहित कईतंत्रों द्वारा एनओ में कम किया जा सकता है।
यह नाइट्रेट-नाइट्राइट-एनओ मार्ग हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत बढ़ाया जाता है जिसमें एनओएस गतिविधि कम हो जाती है क्योंकि एनओएस को एनओ पीढ़ी4 के लिए ऑक्सीजन की आवश्यकता होती है। हाल के कई अध्ययनों ने रक्तचाप विनियमन और व्यायाम प्रदर्शन पर आहार नाइट्रेट के लाभकारी प्रभावों की सूचना दी है, यह सुझाव देते हुए कि नाइट्रेट में कमी के रास्ते एनओ सिग्नलिंग 13,14,15 की वृद्धि में योगदान करते हैं। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि कुछ कंकाल की मांसपेशियां शरीर में प्रमुख नाइट्रेट भंडारण स्थान हैं। रक्त या यकृत जैसे अन्य आंतरिक अंगों की तुलना में, कंकाल की मांसपेशी (ग्लूटस मैक्सिमस) में नाइट्रेट का स्तर काफी अधिक होता है और स्तनधारी शरीर में पर्याप्त द्रव्यमान होता है। ट्रेडमिल व्यायाम को एक चूहे के मॉडल7 में नाइट्राइट में नाइट्रेट की कमी और ग्लूटस में एनओ को बढ़ाने के लिए दिखाया गया था। इन परिणामों का अर्थ है कि कुछ कंकाल की मांसपेशियां शारीरिक स्थितियों में नाइट्रेट में कमी के मार्गों के माध्यम से एनओ के लिए महत्वपूर्ण स्रोत हो सकती हैं। हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि व्यायाम के दौरान मांसपेशियों के नाइट्रेट के स्तर में परिवर्तन सहित ये निष्कर्ष मनुष्यों में भी होतेहैं।
वर्तमान लेखकों में से दो ने पहले रक्त और अन्य तरल नमूनों में नाइट्रेट और नाइट्राइट के स्तर को मापने के लिए एक विधि स्थापितकी थी। हालांकि, जब ऊतक होमोजेनेट्स में इन आयनों के स्तर का शुरू में विश्लेषण किया गया था, तो विस्तृत प्रोटोकॉल उपलब्ध नहीं थे। कई अलग-अलग अंगों में नाइट्रेट-नाइट्राइट-एनओ गतिशीलता को समझने के लिए, हमारा लक्ष्य कंकाल की मांसपेशियों सहित स्तनधारी ऊतकों में नाइट्रेट और नाइट्राइट के स्तर को मापने के लिए एक सटीक और कुशल विधि विकसित करना था। पहले के अध्ययनों में, कृंतक ऊतकों का उपयोग विश्वसनीय समरूपीकरण प्रक्रियाओं को विकसित करने और फिर उन होमोजेनेट्स 7,16,19 में नाइट्रेट और नाइट्राइट सामग्री का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। इस होमोजेनाइजेशन विधि का उपयोग मानव कंकाल की मांसपेशी बायोप्सी नमूनों तक बढ़ाया गया था, जिससे मूल्यों की पुष्टि की गई थी, और महत्वपूर्ण बात यह है कि रक्त / प्लाज्मा की तुलना में मांसपेशियों के लिए देखे गए मूल्य कृन्तकों में देखे गए समान सीमाओं औरअनुपातों में थे। हाल के वर्षों में, अन्य समूहों ने कंकाल की मांसपेशी होमोजेनेट्स में नाइट्रेट और नाइट्राइट के स्तर को मापना शुरू कर दिया, जो हमारे समूह20,21 द्वारा रिपोर्ट किए गए लोगों के लिए तुलनीय मूल्यों की रिपोर्ट करते हैं।
इस प्रोटोकॉल पेपर का उद्देश्य नाइट्रेट और नाइट्राइट स्तरों के बाद के माप के लिए तीन अलग-अलग होमोजेनाइजेशन विधियों का उपयोग करके कंकाल की मांसपेशी होमोजेनेट्स की तैयारी का विस्तार से वर्णन करना है। इसके अतिरिक्त, कंकाल की मांसपेशियों के नमूनों में नाइट्रेट और नाइट्राइट के मूल्यों पर समरूपीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले ऊतक वजन के प्रभावों की जांच की गई। हम मानते हैं कि इन विधियों को आसानी से अन्य प्रकार के स्तनधारी ऊतकों पर लागू किया जा सकता है। हाल ही में, विशेष रूप से व्यायाम शरीर विज्ञान के क्षेत्र में, मांसपेशियों के समूहों के अनुसार नाइट्रेट / नाइट्राइट / एनओ फिजियोलॉजी में संभावित अंतर पर ध्यान दिया गया था। हम चार अलग-अलग कृंतक मांसपेशियों में नाइट्रेट और नाइट्राइट की मात्रा की भी रिपोर्ट करते हैं और इन विभिन्न मांसपेशियों के बीच दोनों आयनों का एक असमान वितरण पाते हैं; एक अवलोकन जिसके लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता होती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
शारीरिक हस्तक्षेप के कार्य के रूप में एनओ मेटाबोलाइट्स, नाइट्रेट और नाइट्राइट में परिवर्तन की निगरानी करने के लिए, विभिन्न अंगों में इन आयनों के स्तर को मापना अनिवार्य है जो उनके चयापचय में महत्वपूर्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एलन एन शेचर, एमडी को इंट्राम्यूरल एनआईएच / एनआईडीडीके अनुदान ज़िया डीके 0251041-14 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Length: 87 mm; Diameter: 30 mm |
| Heparin Sodium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| Nitric Oxide analyzer | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys lysing kit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization |
| Pulverizer kit | Cellcrusher | Cellcrusher kit |
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