Preparação de Homogeneizados do Músculo Esquelético de Rato para Medições de Nitrato e Nitrito
Summary
Apresentamos protocolos para três métodos diferentes para a homogeneização de quatro diferentes grupos musculares de tecido muscular esquelético de ratos para medir e comparar os níveis de nitrato e nitrito. Além disso, comparamos diferentes pesos amostrais para investigar se o tamanho da amostra tecidual afeta os resultados da homogeneização.
Abstract
Íons de nitrato (NO3–) já foram pensados para ser produtos finais inertes do metabolismo do óxido nítrico (NO). No entanto, estudos anteriores demonstraram que os íons nitrato podem ser convertidos de volta ao NO em mamíferos através de um mecanismo de redução de duas etapas: o nitrato sendo reduzido a nitrito (NO2–) principalmente por bactérias comensais orais, em seguida, o nitrito sendo reduzido a NO por vários mecanismos, incluindo através de proteínas contendo heme ou molibdênio. Esta via redutora do nitrato contribui para melhorar as vias de sinalização mediadas pelo NO, particularmente no sistema cardiovascular e durante o exercício muscular. Os níveis de nitrato no organismo antes dessa utilização são determinados por duas fontes diferentes: oxidação endógena do NO e ingestão dietética de nitrato, principalmente de plantas. Para elucidar o complexo ciclo do NO em circunstâncias fisiológicas, examinamos ainda mais a dinâmica de seus metabólitos, nitrato e íons nitrito, que são relativamente estáveis em comparação com o NO. Em estudos anteriores, o músculo esquelético foi identificado como um importante órgão de armazenamento de íons nitrato em mamíferos, bem como uma fonte direta de NO durante o exercício. Portanto, estabelecer uma metodologia confiável para medir os níveis de nitrato e nitrito no músculo esquelético é importante e deve ser útil para estender sua aplicação a outras amostras de tecido. Este artigo explica em detalhes a preparação de amostras de músculo esquelético, utilizando três métodos de homogeneização diferentes, para medições de nitrato e nitrito e discute questões importantes relacionadas aos processos de homogeneização, incluindo o tamanho das amostras. As concentrações de nitrato e nitrito também foram comparadas em quatro grupos musculares diferentes.
Introduction
O óxido nítrico (NO), uma pequena molécula sinalizadora gasosa, desempenha um papel crítico nos processos fisiológicos e fisiopatológicos1. O NO pode ser produzido a partir da L-arginina por enzimas endógenas da família da óxido nítrico sintase (NOS) antes de ser submetido à rápida oxidação em nitrato (NO 3-) e, possivelmente, nitrito (NO 2–) no sangue e nos tecidos 2,3. Recentemente, esses ânions demonstraram ser reduzidos de volta ao NO em sistemas de mamíferos4. O nitrato é convertido em nitrito, principalmente por nitrato redutases bacterianas comensais na cavidade oral atuando sobre íons secretados pelas glândulas salivares e ingeridos diretamente 5 e, em certa medida, por enzimas de mamíferos como a xantina oxidorredutase 6,7. O nitrito pode ser ainda reduzido a NO por vários mecanismos, incluindo desoxihemoglobina8, desoximioglobina9, enzimas contendo molibdênio 10 e redução não enzimática na presença de prótons11,12.
Esta via nitrato-nitrito-NO é reforçada em condições hipóxicas, em que a atividade da NOS é diminuída porque a NOS requer oxigénio para a geração NO4. Muitos estudos recentes têm relatado efeitos benéficos do nitrato dietético na regulação da pressão arterial e no desempenho do exercício, sugerindo que as vias de redução do nitrato contribuem para o aumento da sinalização do NO13,14,15. Estudos anteriores mostraram que alguns músculos esqueléticos são provavelmente os principais locais de armazenamento de nitrato no corpo16. Em comparação com o sangue ou outros órgãos internos, como o fígado, o músculo esquelético (glúteo máximo) contém níveis significativamente mais elevados de nitrato e tem uma massa substancial no corpo dos mamíferos. O exercício em esteira foi mostrado para aumentar a redução de nitrato para nitrito e para NO em glúteos em um modelode rato 7. Esses resultados implicam que alguns músculos esqueléticos podem ser fontes importantes de NO através de vias de redução de nitrato em situações fisiológicas. Estudos mais recentes sugerem que esses achados, incluindo alterações nos níveis de nitrato muscular durante o exercício, também ocorrem em humanos17.
Dois dos autores atuais já haviam estabelecido um método para medir os níveis de nitrato e nitrito no sangue e em outras amostras líquidas18. No entanto, quando os níveis desses ânions em homogeneizados teciduais foram inicialmente analisados, protocolos detalhados não estavam disponíveis. Para entender a dinâmica nitrato-nitrito-NO em vários órgãos diferentes, nosso objetivo foi desenvolver um método preciso e eficiente para medir os níveis de nitrato e nitrito em tecidos de mamíferos, incluindo o músculo esquelético. Em estudos anteriores, tecidos de roedores foram utilizados para desenvolver processos de homogeneização confiáveis e, em seguida, analisar os teores de nitrato e nitrito nesses homogeneizados 7,16,19. O uso desse método de homogeneização foi estendido às amostras de biópsia do músculo esquelético humano, sendo confirmados os valores e, o que é mais importante, os valores observados para o músculo em comparação com o sangue/plasma estavam em faixas e proporções semelhantes às observadas em roedores17. Nos últimos anos, outros grupos também começaram a medir os níveis de nitrato e nitrito em homogeneizados musculares esqueléticos, relatando valores comparáveis aos relatados por nosso grupo20,21.
O objetivo deste trabalho de protocolo é descrever em detalhes a preparação de homogeneizados musculares esqueléticos utilizando três diferentes métodos de homogeneização para posterior medição dos níveis de nitrato e nitrito. Além disso, os efeitos do peso tecidual utilizado para homogeneização sobre os valores de nitrato e nitrito em amostras de músculo esquelético foram examinados. Acreditamos que esses métodos podem ser facilmente aplicados a outros tipos de tecidos de mamíferos. Recentemente, especialmente no campo da fisiologia do exercício, foi dada atenção às possíveis diferenças na fisiologia do nitrato/nitrito/NO de acordo com os grupos musculares. Também relatamos as quantidades de nitrato e nitrito em quatro músculos de roedores diferentes e encontramos uma distribuição não uniforme de ambos os íons entre esses diferentes músculos; uma observação que requer um estudo mais aprofundado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para monitorar as mudanças nos metabólitos do NO, nitrato e nitrito, em função de intervenções fisiológicas, é imperativo medir os níveis desses íons nos diferentes órgãos que são críticos em seu metabolismo. Como a hemoglobina no sangue reagirá com o NO e seus metabólitos, também é importante remover o sangue rapidamente das amostras de tecido, tanto quanto possível. Assim, os animais foram perfundidos com solução salina antes de coletar tecidos musculares esqueléticos (glúteos, TA, EDL, músculo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela concessão intramural do NIH/NIDDK ZIA DK 0251041-14 a Alan N Schechter, MD.
Materials
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Length: 87 mm; Diameter: 30 mm |
| Heparin Sodium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| Nitric Oxide analyzer | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys lysing kit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization |
| Pulverizer kit | Cellcrusher | Cellcrusher kit |
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