Preparación de homogeneizados del músculo esquelético de rata para mediciones de nitratos y nitritos
Summary
Presentamos protocolos para tres métodos diferentes para la homogeneización de cuatro grupos musculares diferentes de tejido muscular esquelético de rata para medir y comparar los niveles de nitrato y nitrito. Además, comparamos diferentes pesos de muestra para investigar si el tamaño de la muestra de tejido afecta los resultados de la homogeneización.
Abstract
Alguna vez se pensó que los iones de nitrato (NO3–) eran productos finales inertes del metabolismo del óxido nítrico (NO). Sin embargo, estudios previos demostraron que los iones de nitrato pueden convertirse de nuevo en NO en mamíferos a través de un mecanismo de reducción de dos pasos: el nitrato se reduce a nitrito (NO2–) principalmente por bacterias comensales orales, luego el nitrito se reduce a NO por varios mecanismos, incluso a través de proteínas que contienen hemo o molibdeno. Esta vía reductora del nitrato contribuye a mejorar las vías de señalización mediadas por NO, particularmente en el sistema cardiovascular y durante el ejercicio muscular. Los niveles de nitrato en el cuerpo antes de tal utilización están determinados por dos fuentes diferentes: oxidación endógena de NO y la ingesta de nitrato en la dieta, principalmente de plantas. Para dilucidar el ciclo complejo de NO en circunstancias fisiológicas, hemos examinado más a fondo la dinámica de sus metabolitos, iones de nitrato y nitrito, que son relativamente estables en comparación con NO. En estudios previos se identificó el músculo esquelético como un importante órgano de almacenamiento de iones de nitrato en mamíferos, así como una fuente directa de NO durante el ejercicio. Por lo tanto, establecer una metodología confiable para medir los niveles de nitrato y nitrito en el músculo esquelético es importante y debería ser útil para extender su aplicación a otras muestras de tejido. Este artículo explica en detalle la preparación de muestras de músculo esquelético, utilizando tres métodos de homogeneización diferentes, para mediciones de nitratos y nitritos y discute cuestiones importantes relacionadas con los procesos de homogeneización, incluido el tamaño de las muestras. Las concentraciones de nitrato y nitrito también se han comparado en cuatro grupos musculares diferentes.
Introduction
El óxido nítrico (NO), una pequeña molécula de señalización gaseosa, desempeña un papel crítico en los procesos fisiológicos y fisiopatológicos1. El NO puede ser producido a partir de L-arginina por enzimas endógenas de la familia de la óxido nítrico sintasa (NOS) antes de someterse a una rápida oxidación a nitrato (NO 3-) y, posiblemente, nitrito (NO2–) en sangre y tejidos 2,3. Recientemente, se ha demostrado que estos aniones se reducen de nuevo a NO en los sistemas de mamíferos4. El nitrato se convierte en nitrito, principalmente por nitrato reductasas bacterianas comensales en la cavidad oral que actúan sobre iones secretados por las glándulas salivales e ingeridos directamente 5, y en cierta medida, por enzimas de mamíferos como la xantina oxidorreductasa 6,7. El nitrito puede reducirse aún más a NO por varios mecanismos, incluyendo la desoxihemoglobina8, la desoximioglobina9, las enzimas que contienen molibdeno 10 y la reducción no enzimática en presencia de protones11,12.
Esta vía nitrato-nitrito-NO se mejora en condiciones hipóxicas en las que la actividad de NOS disminuye porque NOS requiere oxígeno para la generaciónde NO 4. Muchos estudios recientes han reportado efectos beneficiosos del nitrato dietético sobre la regulación de la presión arterial y el rendimiento del ejercicio, sugiriendo que las vías de reducción de nitrato contribuyen al aumento de la señalización de NO13,14,15. Estudios previos han demostrado que algunos músculos esqueléticos son probablemente los principales lugares de almacenamiento de nitrato en el cuerpo16. En comparación con la sangre u otros órganos internos como el hígado, el músculo esquelético (glúteo mayor) contiene niveles significativamente más altos de nitrato y tiene una masa sustancial en el cuerpo de los mamíferos. Se demostró que el ejercicio en cinta rodante mejora la reducción de nitratos a nitrito y NO en glúteos en un modelo de rata7. Estos resultados implican que algunos músculos esqueléticos podrían ser fuentes importantes de NO a través de vías de reducción de nitratos en situaciones fisiológicas. Estudios más recientes sugieren que estos hallazgos, incluyendo cambios en los niveles de nitrato muscular durante el ejercicio, también ocurren en humanos17.
Dos de los autores actuales habían establecido previamente un método para medir los niveles de nitrato y nitrito en muestras de sangre y otros líquidos18. Sin embargo, cuando se analizaron inicialmente los niveles de estos aniones en homogeneizados tisulares, no se disponía de protocolos detallados. Para comprender la dinámica nitrato-nitrito-NO en varios órganos diferentes, nuestro objetivo era desarrollar un método preciso y eficiente para medir los niveles de nitrato y nitrito en tejidos de mamíferos, incluido el músculo esquelético. En estudios anteriores, los tejidos de roedores fueron utilizados para desarrollar procesos de homogeneización confiables y luego analizar el contenido de nitrato y nitrito en esos homogeneizados 7,16,19. El uso de este método de homogeneización se extendió a muestras de biopsia de músculo esquelético humano, por lo que los valores fueron confirmados, y es importante destacar que los valores observados para el músculo en comparación con la sangre / plasma estaban en rangos y proporciones similares a los observados en roedores17. En los últimos años, otros grupos también comenzaron a medir los niveles de nitrato y nitrito en homogeneizados del músculo esquelético, reportando valores comparables a los reportados por nuestro grupo20,21.
El objetivo de este documento de protocolo es describir en detalle la preparación de homogeneizados del músculo esquelético utilizando tres métodos de homogeneización diferentes para la medición posterior de los niveles de nitrato y nitrito. Además, se examinaron los efectos del peso del tejido utilizado para la homogeneización sobre los valores de nitrato y nitrito en muestras de músculo esquelético. Creemos que estos métodos se pueden aplicar fácilmente a otros tipos de tejidos de mamíferos. Recientemente, especialmente en el campo de la fisiología del ejercicio, se había prestado atención a las posibles diferencias en la fisiología de nitrato/nitrito/NO según los grupos musculares. También informamos las cantidades de nitrato y nitrito en cuatro músculos roedores diferentes y encontramos una distribución no uniforme de ambos iones entre estos músculos diferentes; una observación que requiere más estudio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para monitorear los cambios en los metabolitos de NO, nitrato y nitrito, en función de las intervenciones fisiológicas, es imperativo medir los niveles de estos iones en los diferentes órganos que son críticos en su metabolismo. Como la hemoglobina en la sangre reaccionará con el NO y sus metabolitos, también es importante eliminar la sangre rápidamente de las muestras de tejido tanto como sea posible. Por lo tanto, los animales fueron perfundidos con solución salina antes de recolectar tejidos del músculo esque…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la subvención intramuros de NIH / NIDDK ZIA DK 0251041-14 a Alan N Schechter, MD.
Materials
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Length: 87 mm; Diameter: 30 mm |
| Heparin Sodium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| Nitric Oxide analyzer | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys lysing kit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization |
| Pulverizer kit | Cellcrusher | Cellcrusher kit |
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