在这里,我们将展示如何使用三明治冷冻装置快速冷冻生物标本,包括细菌,酵母,培养细胞,分离细胞,动物和人体组织以及病毒。我们还展示了如何在快速冷冻后为超薄切片制备试样。
化学固定已用于观察细胞和组织的超微结构。然而,这种方法不能充分保留细胞的超微结构;通常观察到细胞内容物的伪影和提取。快速冷冻是保存细胞结构的更好选择。活酵母或细菌的三明治冷冻,然后冷冻取代已被用于观察细胞的精细天然超微结构。最近,戊二醛固定培养细胞或人体组织的三明治冷冻也被用于揭示细胞和组织的超微结构。
到目前为止,这些研究都是用手工制作的三明治冷冻装置进行的,在其他实验室的研究应用有限。最近制造了一种新的三明治冷冻装置,现已上市。本文介绍了如何使用三明治冷冻装置快速冷冻生物标本,包括细菌、酵母菌、培养细胞、分离细胞、动物和人体组织以及病毒。还显示了快速冷冻后用于超薄切片的试样的制备以及冷冻取代,树脂包埋,块的修剪,超薄切片的切割,切片的回收,染色以及用支撑膜覆盖网格的程序。
电子显微镜是研究细胞超微结构的强大工具。使用常规脱水程序进行化学固定已用于观察细胞和组织的超微结构。然而,这种方法不能充分保存细胞的超微结构,并且通常观察到伪影和细胞内容物的提取。细胞和组织的快速冷冻和冷冻取代是保存细胞结构的更好选择。
快速冷冻细胞主要采用三种方法1:1)通过将标本放入冷却的冷冻剂(如丙烷)中进行骤降冷冻,并且自20世纪50年代初以来一直使用2;2)冷金属块冷冻是通过将细胞和组织快速撞击到用液氮或液氦3,4冷却的金属块上进行的;3)高压冷冻是通过在高压5,6,7下用液氮冷冻细胞和组织来完成的。
三明治冷冻是一种骤停冷冻,通过将薄的生物材料夹在两个铜盘之间,然后通过插入液态丙烷8,9,10来快速冷冻它们。在这种方法中,使用从两侧具有良好导热性的金属用冷冻剂快速冷却非常薄的试样(几微米厚)。因此,这种方法有效地从标本中除去热量,使得可以稳定地冷冻细胞而不会造成冰晶损伤。三明治冷冻,然后冷冻取代活酵母和细菌细胞,揭示了细胞10,11,12,13,14,15,16的天然超微结构。
最近,该方法已被发现可用于保存戊二醛固定微生物17、18、19、20、21、22、23、24、培养细胞25、26、27、以及人类细胞和组织的清晰细胞图像1、28 .虽然这些研究是使用手工制作的三明治冷冻装置29进行的,并且在其他实验室的其他研究中的应用受到限制,但已经制造了一种新的三明治冷冻装置(SFD)28,现在已经商业化。
本文展示了如何使用SFD快速冷冻生物标本,包括细菌,酵母,培养细胞,分离细胞,动物和人体组织以及病毒。图中还显示了快速冷冻后用于超薄切片的试样的制备,以及冷冻置换、树脂包埋、块修剪、超薄切片切割、切片回收、染色和用支撑膜覆盖网格的程序。
以下讨论基于对1,000多个样品进行的120多个三明治冷冻 – 冷冻替代实验,以及超过76年来对超过75个样品进行的70多个快速冷冻 – 冷冻 – 冷冻电子显微镜实验。
三明治冷冻良好冷冻的成功率
实现良好冷冻的成功率取决于样品。酿酒酵母(酵母)细胞在YPD培养基(1%酵母提取物,2%蛋白胨,2%葡萄糖)中培养,对良好冷冻而不形成冰晶的成功率接近10,11,15,35,36。其他酵母种类,包括Shizosaccharomyces37,38,39,隐球菌14,40,41,42,43,44,45,Exophiala 13,41,46,47,48, 49、镰刀菌50、51、52、金黄色葡萄球菌53、念珠菌54、55、菌丝菌56、曲霉菌57和毛滴虫孢子菌也显示出良好的冷冻效果。细菌,包括分枝杆菌58、59和大肠杆菌16,也显示出良好的冷冻效果。培养的细胞和分离的动物细胞对活细胞和戊二醛固定细胞1,25,26,27,60均显示出良好的冷冻效果。将戊二醛固定的动物和人体组织切片至0.1~0.2毫米厚度时也显示出良好的冷冻效果1、28。
良好冷冻的条件
仅使用处于适当生长阶段和条件下的细胞。培养中的细胞应处于指数阶段。在铜盘上施用非常少量的浓缩样品的细胞悬浮液(对于 酿酒酵母,〜0.02μL的3-5×109 个细胞/ mL)。戊二醛固定的动物或人体组织切片也应该非常小(优选0.3毫米x 0.3毫米×0.1毫米)。由于切割0.1毫米厚的组织切片很困难,因此要切片许多组织并选择薄片和半透明切片。快速但仔细地工作,不要让样品变干。在用镊子捡起堆叠的铜盘时,不要用力按压圆盘以避免压碎细胞和组织。试样装载是成功冷冻的最重要步骤,所需的条件与高压冷冻的良好冷冻条件相同。读者应该参考麦当劳61的精彩评论。
其他应用
本文介绍了细菌,酵母,培养细胞,分离的动物细胞,人体组织和病毒颗粒的电子显微镜照片。我们观察到戊二醛固定海藻的良好冷冻。然而,活淡水绿藻的细胞结构被冰晶形成破坏。将细胞与20%牛血清白蛋白(BSA)混合,确保超微结构保存完好,没有冰晶损伤。使用20%BSA也有利于保存蘑菇茎细胞的超微结构。通过应用20%BSA冷冻植物细胞和组织的实验正在进行中。尽管尚未尝试对三明治冷冻冷冻取代样品进行扫描电子显微镜检查,但先前已报道过对保存完好的细胞结构的观察9。
关于三明治冷冻方法的注意事项
细胞的接近天然的超微结构最好通过活细胞的快速冷冻和冷冻取代来观察。通过将细胞的厚度限制在≤30μm1,可以避免SFD形成冰晶。用戊二醛固定组织通常可以更好地保存细胞结构以观察悬浮培养的细胞,因为戊二醛固定使细胞结构更加坚硬,并防止在活细胞的收集和离心过程中可能发生的超微结构变化1。戊二醛固定也允许将冷冻深度扩展到0.2 mm1,类似于高压冷冻(HPF)方法。因此,HPF机器可以用SFD代替,用于动物和人体组织的深度冷冻。
由于戊二醛固定组织可以储存2年以上28年,三明治冷冻可以根据用户的方便进行。用戊二醛固定组织也有助于组织切片,因为固定后组织变得更加僵硬。与HPF机器不同,SFD可用于快速冷冻病毒以进行冷冻电子显微镜检查以及细菌和真核细胞。此外,与HPF机器相比,SFD体积小,便于携带,价格便宜,并且可以被更多的实验室购买。我们希望SFD的这些特点能够帮助更多的实验室实现他们的研究目标28.
细胞自然形态的特征
如果细胞结构表现出以下外观,则细胞结构处于自然状态:外膜的膜结构(图12A,B),质膜(图12B,C;图 13A–D;和图14E)、核包膜(图12C、图13B-D和图14D-E)、线粒体(图12C、图13C和图14D)和液泡(图12C)显示平滑的轮廓。细胞核和液泡几乎是圆形的(图12C)。核糖体显示出清晰的电子致密外观,直径约为20nm(图12B,C;图 13C;和图 14D)。细胞质是电子透明的(图12B,C;图 13C;和图 14D)。
戊二醛固定对细胞形态的影响
在三明治冷冻之前对动物或人体组织进行戊二醛固定,以获得无冰晶的超微结构。通过这种方法获得的显微照片显示出与活组织快速冷冻所获得的图像相似的精细清晰的图像(图14)1。对酵母细胞、深海微生物和培养细胞的研究表明,超微结构的变形主要是由于四氧化锇在室温1、17、18、28下被乙醇固定和脱水所致。Small还报道说,尽管戊二醛固定不会破坏培养的成纤维细胞中肌动蛋白的组织,但四氧化锇在室温下通过丙酮或乙醇固定和脱水破坏了肌动蛋白组织62。
因此,应详细研究戊二醛固定对细胞形态的影响。Ohno开发了一种 体内 冷冻固定方法,其中活组织在不停止血液供应的情况下被快速冷冻63。将组织冷冻取代并包埋在环氧树脂中,并观察到超薄切片。电子显微镜图像显示,与通过化学固定 – 常规脱水和新鲜未固定组织快速冷冻获得的超微结构相比,活组织的最接近天然超微结构。因此,比较戊二醛固定-冷冻置换(本方法)和 体内冷冻- 冷冻置换获得的超微结构来检验戊二醛固定的影响,可能会很有趣。
考虑环境和提高实验效率
我们使用2 mL塑料管代替树脂。一毫升稀释的树脂足以满足每个替代步骤。每次实验后,可以使用的塑料管丢弃。当玻璃瓶用于树脂替代时,这可以节省清洗玻璃瓶的时间和精力。此外,乙酸铀酰溶液可重复用于切片染色32。对切片进行染色后,可以保存乙酸铀酰溶液并重复使用。由于乙酸铀酰是一种放射性物质,其再利用有助于避免产生废物,并有助于保护环境。
等离子聚合萘薄膜
等离子体聚合萘薄膜是由萘气体在辉光放电33下通过等离子体聚合而制成的三维聚合碳膜。该薄膜对电子轰击和化学物质具有弹性,非常干净,对电子透明,并且具有平坦的表面和无定形结构。因此,市售的等离子体聚合萘薄膜非常出色,建议将其作为支撑膜。
The authors have nothing to disclose.
没有
Sandwich Freezing Device | Marine works Japan, Ltd, Yokosuka, Japan | MW-SFD-01 | with metal bar, thin metal bar, tweezers, and working bath |
10 mL glass vials | – | Scintillation counter vials for fixative | |
Acetone | – | ||
Osmium tetroxide | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 3004 | 0.1 g |
Deep freezer | Sanyo Co. Ltd., Osaka | MDF-C8V1 | |
Copper disk | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | – | Refer to this paper |
Slide glass | – | ||
Double-sided adhesive tape | – | ||
Single-edged razor blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | – | Feather, FAS-10 |
Double-edged razor blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | – | Feather, FA-10 |
Shredded board | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 428 | |
Tweezers | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | – | Several pairs |
Tweezers with polystyrene foam | – | One pair | |
Glutaraldehyde | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 3052 | |
Liquid nitrogen | – | ||
Propane gas | – | Cryogen | |
Ion sputter apparatus | Hitachi high technologies, Tokyo | Hitachi E102 | |
Micropipette | – | For 1 mL, 200 μL, and 2 μL | |
Microcentrifuge | Tomy digital biology Co. Ltd., Tokyo | Capsulefuge, PMC-060 | |
Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. | – | SMZ 645 |
LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. | SM-LW 61 Ji | |
Disposable plastic container | – | 50 mL and 200 mL | |
Ethane gas | – | Cryogen | |
2 mL Eppendorf tubes | – | For embedding | |
Disposable plastic syringes | – | 1 mL, 5 mL, 10 mL, and 20 mL | |
Magnetic stirrer | – | ||
Epoxy resin | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 340 | Quetol 812 set |
Silicon embedding mold | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 4217 | 7 mm in diameter, 13 mm deep |
Incubater | – | For 37 °C and 60 °C | |
Trimming stage | Sunmag Co. Ltd., Tokyo | – | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
LED illumination for trimming stage | Sunmag Co. Ltd., Tokyo | – | Refer to this paper |
Ultrasonic Trimming Blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | Ultracut S | |
Grids | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2633, 2634 | 300 mesh, 400 mesh |
0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
Perfect Loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2351 | Fot retrieving sections |
Half Tube for section staining | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this pape |
Syringe filter | Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo | DISMIC-03CP | Cellulose acetate, 0.45 μm |
Transmission electron microscope | JEOL Co. Ltd., Tokyo | JEM-1400 |