인간 다능성 줄기 세포에서 3D 망막 조직의 파생을 위한 망막 오르간로이드 유도 시스템
Summary
여기서 우리는 다양한 인간 다능성 줄기 세포주에 적합한 최적화된 망막 오르간성 유도 시스템을 설명하여 높은 재현성과 효율성을 가진 망막 조직을 생성합니다.
Abstract
망막 퇴행성 질환은 효과적인 치료없이 돌이킬 수없는 실명의 주요 원인입니다. 망막 세포의 모든 모형으로 분화할 가능성이 있는 만능 줄기 세포, 심지어 미니 망막 조직조차, 이 질병을 가진 환자를 위한 거대한 약속을 개최하고 질병 모델링 및 약 검열에 있는 많은 기회를 보유합니다. 그러나 hPSCs에서 망막 세포에 이르는 유도 과정은 복잡하고 시간이 많이 소요됩니다. 여기서, 우리는 다양한 인간 다능성 줄기 세포에 적합한 높은 재현성과 효율성을 가진 망막 조직을 생성하기 위하여 최적화된 망막 유도 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 원뿔 광수용체의 농축에 유익한 망막산을 첨가하지 않고 수행됩니다. 이 프로토콜의 장점은 망막 유도의 효율성과 반복성을 크게 향상시키기 위해 EB 크기와 도금 밀도의 정량화입니다. 이 방법을 사용하면 모든 주요 망막 세포가 순차적으로 나타나고 망막 발달의 주요 단계를 다시 수거합니다. 질병 모델링 및 세포 치료와 같은 다운스트림 응용 프로그램을 용이하게 합니다.
Introduction
노화와 관련된 황반 변성(AMD) 및 망막색색소증(RP)과 같은 망막 퇴행성 질환(RDs)은 광수용체 세포의 기능 장애 및 사망을 특징으로 하며 전형적으로 효과적인 치료 방법 없이 돌이킬 수 없는 시력 상실로이어집니다. 이러한 질병의 근본적인 기계장치는 인간 질병 모형2의부족 때문에 부분적으로 알려지지 않았습니다. 지난 수십 년 동안 줄기 세포 기술을 통해 재생 의학에서 상당한 발전이 이루어졌습니다. 우리 자신을 포함한 많은 연구자들은 인간 배아 줄기 세포 (hESC)와 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)를 포함한 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)가 모든 종류의 망막 세포로 분화 할 수 있음을 보여주었으며, 다양한 분화 접근법3,4,5,6, 7,7, 8,9, 10,10, 10 도 11,질병 모델링 및 세포 치료에서 큰 잠재력을 제공하는12,13,14.
그러나 hPSCs에서 망막 세포에 이르는 유도 과정은 매우 복잡하고 반복성이 낮은 시간이 소요되며, 풍부한 경험과 높은 기술을 가진 연구원이 필요합니다. 복잡하고 역동적인 유도 과정에서 여러 가지 요인이 망막 조직의수율(15,16,17)에영향을 미칩니다. 또한, 상이한 유도 방법은 종종 샘플 수집 및 데이터 해석3을혼동할 수 있는 망막 마커의 타이밍과 견고한 발현에 상당히 차이가 있다. 따라서 단계별 지침이 있는 hPSC에서 망막 분화의 간단한 프로토콜이 수요가 있을 것입니다.
여기서, 당사의 발표된 연구18,19,20,21을기반으로, hPSC로부터 풍부한 콘 광수용체를 가진 망막 오르가노이드(ROs)를 생성하는 최적화된 망막 유도 프로토콜이 설명되어 있으며, 이는 레티노산(RA)의 보충제를 필요로 하지 않는다. 이 프로토콜은 신경 망막 및 RPE를 생성하는 다단계 방법의 설명에 중점을 둡니다. EB 형성은 초기 유도 단계의 필수적인 부분입니다. EB의 크기와 도금 밀도는 정량적으로 최적화되어 있으며, 이는 망막 조직의 수율을 과학적으로 향상시키고 반복성을 촉진합니다. 유도의 두 번째 부분에서, 광학 소포(OV)는 서스펜션 문화에서 준수 문화와 RO 형태로 자체 구성; 이 부분의 시간 과정과 효율성은 hPSC 라인에서 상당히 다릅니다. ROs의 망막 세포의 성숙 및 사양은 주로 유도의 중간 및 후기 단계에서 발생합니다. RA를 첨가하지 않고, 풍부한 원콘과 막대를 모두 갖춘 성숙한 광수용체를 생산할 수 있습니다.
이 프로토콜의 목적은 경험이 부족한 연구원이 반복할 수 있도록 각 단계를 정량적으로 설명하고 자세히 설명하는 것입니다. 다양한 hPSC 라인은 콘이 풍부한 망막 조직의 강력한 수율과 높은 반복성을 가진 이 프로토콜에 의해 로오스로 성공적으로 유도되었습니다. 이 프로토콜을 가진 HPSCs 유래 RSo는 생체 내에서망막 발달의 주요 단계를 재구성하고 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 세포 치료와 같은 다운스트림 응용 프로그램을 용이하게 하는 장기적인 생존을 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 다단계 망막 유도 프로토콜에서 hPSC는 망막 운명을 얻기 위해 단계적으로 안내되었고 적층 NR 및 RPE를 포함하는 망막 오르가노이드로 자체 조직되었습니다. 분화 하는 동안, hPSCs는 생체 내에서인간 망막 발달의 모든 주요 단계를 재구성, EF에서, OV, 그리고 RPE, 망막 적각에, 망막 신경절 세포를 포함 하 여 망막 세포의 모든 하위 유형을 생성, 백막 세포, 양극성 세포, 막대, 그리고 원뿔 광?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국의 국가 키 R&D 프로그램 (2016YFC1101103)에 의해 지원되었다, 2017YFA0104101), 광저우 과학기술프로젝트기금(201803010078), 광동성 과학기술프로젝트(2017B020230003), 중국 자연과학재단(NSF), 중국 자연과학재단(nsF), 81570874, 81970842), 선야센대학의 100여 인재 프로그램(PT10010100), 및 기초연구기금의 기초연구기금.
Materials
| (−)-Blebbistatin | Sigma | B0560-5mg | ROCK-inhibitor |
| 1 ml tips | Kirgen | KG1313 | 1 ml |
| 10 ml pipette | Sorfa | 3141001 | Pipette |
| 100 mm Tissue culture | BIOFIL | TCD000100 | 100 mm Petri dish |
| 100 mm Tissue culture | Falcon | 353003 | 100 mm Petri dish |
| 15 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011150 | Centrifuge tubes |
| 35 mm Tissue culture dishes | Falcon | 353001 | 35 mm Petri dish |
| 5 ml pipette | Sorfa | 313000 | Pipette |
| 50 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011500 | Centrifuge tubes |
| 6 wells tissue culture plates | Costar | 3516 | Culture plates |
| Anti-AP2α Antibody | DSHB | 3b5 | Primary antibody |
| ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X | Gibco | 15240062 | Antibiotic-Antimycotic |
| Anti-ISL1 Antibody | Boster | BM4446 | Primary antibody |
| Anti-Ki67 Antibody | Abcam | ab15580 | Primary antibody |
| Anti-L/M opsin Antibody | gift from Dr. jeremy | / | Primary antibody |
| Anti-PAX6 Antibody | DSHB | pax6 | Primary antibody |
| Anti-rabbit 555 | Invitrogen | A31572 | Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-Recoverin Antibody | Millipore | ab5585 | Primary antibody |
| Anti-Rhodopsin Antibody | Abcam | ab5417 | Primary antibody |
| Anti-sheep 555 | Invitrogen | A21436 | Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-SOX9 Antibody | Abclonal | A19710 | Primary antibody |
| Anti-VSX2 Antibody | Millipore | ab9016 | Primary antibody |
| B-27 supplement W/O VIT A (50X) | Gibco | 12587010 | Supplement |
| Cryotube vial | Thermo scientific-NUNC | 375418 | 1.8 ml |
| DAPI | DOJINDO | D532 | 4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max | Sigma | D2650-100ML | Multiple suppliers |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Medium |
| DMEM /F12 | Gibco | C11330500BT | Medium |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | 0.5 M PH 8.0 |
| FBS | NATOCOR | SFBE | Serum |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22μm, sterile Millex filter |
| GlutaMax, 100X | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine |
| Heparin | Sigma | H3149 | 2 mg/ml in PBS to use |
| Matrigel, 100x | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | MEM NEAA |
| mTeSR1 | STEM CELL | 85850 | hPSCs maintenance medium (MM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | Supplement |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer | GNM | GNM10010 | Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M |
| Taurine | Sigma | T0625 | Supplement |
| Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment | Corning | CLS3262-20EA | Petri dish |
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