ヒト多能性幹細胞からの3Dレチナル組織の導出のためのレチナルオガノイド誘導システム
Summary
ここでは、ヒトの多能性幹細胞株が再現性と効率の高い人工組織を生成するのに適した最適化されたレチナルオルガノイド誘導システムについて説明します。
Abstract
レチンバル性疾患は、効果的な治療を伴わない不可逆的失明の主な原因である。多能性幹細胞は、あらゆるタイプのレチナル細胞(ミニレチナル組織)に分化する可能性を秘めており、これらの疾患を有する患者に対して大きな約束をし、疾患モデリングや薬物スクリーニングにおいて多くの機会を得ています。しかし、hPSCからレチナル細胞への誘導プロセスは複雑で時間がかかります。ここでは、多様なヒト多能性幹細胞に適した、高い再現性と効率を持つレチナル組織を生成するための最適化されたレチナル誘導プロトコルについて述べます。このプロトコルは、レチノイン酸を添加することなく実行され、これは錐体の光受容体の濃縮に利益をもたらします。このプロトコルの利点は、レチン誘導の効率と再現性を大幅に向上させるEBサイズとめっき密度の定量化です。この方法では、すべての主要なレチン細胞が順次現れ、レチンの主な段階を再現します。疾患のモデル化や細胞治療などの下流のアプリケーションを容易にします。
Introduction
網膜変性疾患(RD)は、加齢黄斑変性症(AMD)および網膜色素変性症(RP)などの、光受容体細胞の機能不全および死を特徴とし、典型的には、効果的な治療法なしに不可逆的な視力喪失を導く1。これらの疾患の根底にあるメカニズムは、ヒト疾患モデル2の不足のために部分的にはほとんど知られていない。過去数十年にわたり、幹細胞技術を通じて再生医療において大きな進歩が遂げられています。私たち自身を含む多くの研究者は、ヒト胚性幹細胞(hESC)およびヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)を含むヒト多能性幹細胞(hPSC)が、様々な分化アプローチ3、4、5、7、8、9、10を介してあらゆるタイプのレチナル細胞に分化できることを示している。11、疾患のモデリングと細胞療法12、13、14に大きな可能性を提供する。
しかし、hPSCからレチナル細胞への誘導プロセスは非常に複雑で時間がかかり、再現性が低いため、経験豊富で高いスキルを持つ研究者が必要です。複雑で動的な誘導プロセスの間、多くの要因が、15、16、17の組織の収率に影響を与えます。また、異なる誘導方法は、しばしば、サンプル収集とデータ解釈を混乱させる可能性のある、レチンマーカーのタイミングと堅牢な発現でかなり異なる。したがって、ステップバイステップのガイダンスを持つhPSCからのレチナル分化の簡単なプロトコルが必要になります。
ここでは、18,19,20,21の研究に基づき、hPSCから豊富な円錐型感光体を有するレチナルオガノイド(R)を生成するための最適化されたレチナル誘導プロトコルが記載されており、レチノイン酸(RA)のサプリメントを必要としない。このプロトコルは、神経のレティナとRPEを生成するマルチステップ法の記述に焦点を当てています。EB形成は、早期誘導段階の必須部分です。EBsのサイズとめっき密度の両方が定量的に最適化され、これは科学的に、レチン組織の収量を高め、反復性を促進します。誘導の第2部では、光学小胞(OV)は、懸濁液培養におけるアドヒアランス培養およびROV形態において自己組織化する。この部分のタイムコースと効率は、異なるhPSCラインで大きく異なります。Rの細胞の成熟と指定は、主に誘導の中間段階と後期段階で起こります。RAを添加することなく、豊かなコーンとロッドの両方を持つ成熟した感光体を作り出すことができます。
このプロトコルの目的は、経験の浅い研究者が繰り返すために各ステップを定量的に記述し、詳細に記述することです。さまざまなhPSCラインは、このプロトコルにより、錐が豊富なレチナル組織の堅牢な収率と高い再現性を持つROsにうまく誘導されています。このプロトコルを用いたHPSCs由来のROsは 、生体内でのレチナル開発の主なステップを再現し、疾患モデリング、薬物スクリーニング、細胞治療などの下流のアプリケーションを容易にする長期的な生存を可能にします。
Protocol
1. hPSCの文化と拡大 HPSC 文化 細胞外マトリックス(ECM、hESC修飾マトリックス)で6ウェルプレートの2つのウェルをコーティングします。Dulbeccoの修正イーグル培地(DMEM)に8-12 μg/mLのECMを含むECM溶液50 mLを調製します。DMEMの49 mLに、解凍したECMストック溶液(50x)を1 mL加えます。6ウェルプレートの各ウェルにECM溶液1mLを加えます。37°Cおよび5%CO2でインキュベーターに1時間?…
Representative Results
このプロトコルのレチナル誘導プロセスは、ヒト胎児の胎児の発育を模倣する。レチナリの分化を開始するために、hPSCを小さな塊に解き分け、懸濁液中で培養して、EBの形成を誘導した。D1では、均一な細胞凝集体またはEBが形成される(図1C)。培養培地は徐々にNIMに移行した。D5では、ECMコーティングされた文化料理にEBをメッキしました。細胞は徐々にエブから移行し?…
Discussion
この多段階のレチナル誘導プロトコルでは、hPSCを、レチナル運命を得るためにステップバイステップで導かれ、かつ、積層NRおよびRPEを含むレチナルオルガノイドに自己組織化した。分化の間、hPSCは、EF、OV、RPEから、レチナルラミネート、レチナル細胞、アマクライン細胞、双極細胞、ロッド、円錐光受容体、および円膜のグリア細胞および時間的空間細胞および時間的空間細胞における?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国の国家キーR&Dプログラム(2016YFC1101103、 2017YFA0104101)、広州科学技術プロジェクト基金(201803010078)、広東省科学技術プロジェクト(2017B020230003)、中国自然科学財団(81570874、81970842)、孫文大学(PT1001010)の100人の人材プログラム、および主要研究所の基礎研究基金
Materials
| (−)-Blebbistatin | Sigma | B0560-5mg | ROCK-inhibitor |
| 1 ml tips | Kirgen | KG1313 | 1 ml |
| 10 ml pipette | Sorfa | 3141001 | Pipette |
| 100 mm Tissue culture | BIOFIL | TCD000100 | 100 mm Petri dish |
| 100 mm Tissue culture | Falcon | 353003 | 100 mm Petri dish |
| 15 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011150 | Centrifuge tubes |
| 35 mm Tissue culture dishes | Falcon | 353001 | 35 mm Petri dish |
| 5 ml pipette | Sorfa | 313000 | Pipette |
| 50 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011500 | Centrifuge tubes |
| 6 wells tissue culture plates | Costar | 3516 | Culture plates |
| Anti-AP2α Antibody | DSHB | 3b5 | Primary antibody |
| ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X | Gibco | 15240062 | Antibiotic-Antimycotic |
| Anti-ISL1 Antibody | Boster | BM4446 | Primary antibody |
| Anti-Ki67 Antibody | Abcam | ab15580 | Primary antibody |
| Anti-L/M opsin Antibody | gift from Dr. jeremy | / | Primary antibody |
| Anti-PAX6 Antibody | DSHB | pax6 | Primary antibody |
| Anti-rabbit 555 | Invitrogen | A31572 | Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-Recoverin Antibody | Millipore | ab5585 | Primary antibody |
| Anti-Rhodopsin Antibody | Abcam | ab5417 | Primary antibody |
| Anti-sheep 555 | Invitrogen | A21436 | Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-SOX9 Antibody | Abclonal | A19710 | Primary antibody |
| Anti-VSX2 Antibody | Millipore | ab9016 | Primary antibody |
| B-27 supplement W/O VIT A (50X) | Gibco | 12587010 | Supplement |
| Cryotube vial | Thermo scientific-NUNC | 375418 | 1.8 ml |
| DAPI | DOJINDO | D532 | 4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max | Sigma | D2650-100ML | Multiple suppliers |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Medium |
| DMEM /F12 | Gibco | C11330500BT | Medium |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | 0.5 M PH 8.0 |
| FBS | NATOCOR | SFBE | Serum |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22μm, sterile Millex filter |
| GlutaMax, 100X | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine |
| Heparin | Sigma | H3149 | 2 mg/ml in PBS to use |
| Matrigel, 100x | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | MEM NEAA |
| mTeSR1 | STEM CELL | 85850 | hPSCs maintenance medium (MM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | Supplement |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer | GNM | GNM10010 | Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M |
| Taurine | Sigma | T0625 | Supplement |
| Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment | Corning | CLS3262-20EA | Petri dish |
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Cite This Article
Guan, Y., Xie, B., Zhong, X. Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (170), e62435, doi:10.3791/62435 (2021).