Retinale Organoid-Induktionssystem zur Ableitung von 3D-Netzhautgewebe aus humanen pluripotenten Stammzellen
Summary
Hier beschreiben wir ein optimiertes retinale Organoid-Induktionssystem, das für verschiedene humane pluripotente Stammzelllinien geeignet ist, netzhautähnliche Gewebe mit hoher Reproduzierbarkeit und Effizienz zu erzeugen.
Abstract
Degenerative Erkrankungen der Netzhaut sind die Hauptursachen für irreversible Erblindung ohne wirksame Behandlung. Pluripotente Stammzellen, die das Potenzial haben, sich in alle Arten von Netzhautzellen zu differenzieren, sogar in Mini-Netzhautgewebe, sind für Patienten mit diesen Krankheiten vielversprechend und bieten viele Möglichkeiten bei der Krankheitsmodellierung und dem Arzneimittelscreening. Der Induktionsprozess von hPSCs zu Netzhautzellen ist jedoch kompliziert und zeitaufwendig. Hier beschreiben wir ein optimiertes retinales Induktionsprotokoll zur Erzeugung von Netzhautgewebe mit hoher Reproduzierbarkeit und Effizienz, das für verschiedene humane pluripotente Stammzellen geeignet ist. Dieses Protokoll wird ohne Zusatz von Retinsäure durchgeführt, was der Anreicherung von Zapfenphotorezeptoren zugute kommt. Der Vorteil dieses Protokolls ist die Quantifizierung der EB-Größe und der Beschichtungsdichte, um die Effizienz und Wiederholbarkeit der Netzhautinduktion signifikant zu verbessern. Mit dieser Methode erscheinen alle wichtigen Netzhautzellen nacheinander und rekapitulieren die Hauptschritte der Netzhautentwicklung. Es wird nachgelagerte Anwendungen wie Krankheitsmodellierung und Zelltherapie erleichtern.
Introduction
Retinale degenerative Erkrankungen (RDs), wie altersbedingte Makuladegeneration (AMD) und Retinitis pigmentosa (RP), sind durch die Dysfunktion und den Tod von Photorezeptorzellen gekennzeichnet und führen typischerweise zu irreversiblem Sehverlust ohne wirksame Heilungsmöglichkeiten1. Der Mechanismus, der diesen Krankheiten zugrunde liegt, ist weitgehend unbekannt, teilweise aufgrund fehlender menschlicher Krankheitsmodelle2. In den letzten Jahrzehnten wurden in der regenerativen Medizin durch die Stammzelltechnologie bedeutende Fortschritte erzielt. Viele Forscher, einschließlich uns, haben gezeigt, dass menschliche pluripotente Stammzellen (hPSCs), einschließlich menschlicher embryonaler Stammzellen (hESCs) und humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPSCs), sich durch verschiedene Differenzierungsansätze in alle Arten von Netzhautzellen, sogar in Mini-Netzhautgewebe, differenzieren können3,4,5,6,7,8,9,10, 11, bietet ein enormes Potenzial in der Krankheitsmodellierung und Zelltherapie12,13,14.
Der Induktionsprozess von hPSCs zu Netzhautzellen ist jedoch sehr kompliziert und zeitaufwendig mit geringer Wiederholbarkeit, was Forscher mit reicher Erfahrung und hohen Fähigkeiten erfordert. Während des komplexen und dynamischen Induktionsprozesses beeinflussen eine Reihe von Faktoren die Ausbeute an Netzhautgeweben15,16,17. Außerdem unterscheiden sich verschiedene Induktionsmethoden oft erheblich im Timing und in der robusten Expression von Netzhautmarkern, was die Probenentnahme und Dateninterpretation verwirren könnte3. Daher wäre ein einfaches Protokoll der netztinalen Differenzierung von hPSCs mit Schritt-für-Schritt-Anleitung gefragt.
Hier wird basierend auf unseren veröffentlichten Studien18,19,20,21, ein optimiertes retinales Induktionsprotokoll zur Erzeugung von Netzhautorganoiden (ROs) mit reichen Zapfenphotorezeptoren aus hPSCs beschrieben, die keine Ergänzung von Retinsäure (RA) erfordern. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Beschreibung der mehrstufigen Methode zur Erzeugung neuronaler Netzhaut und RPE. Die EB-Bildung ist der wesentliche Teil der frühen Induktionsphase. Sowohl Größe als auch Beschichtungsdichte von EBs sind quantitativ optimiert, was die Ausbeute von Netzhautgewebe wissenschaftlich erhöht und die Wiederholbarkeit fördert. Im zweiten Teil der Induktion organisieren sich optische Vesikel (OVs) in der Adhärenzkultur selbst und ROs bilden sich in der Suspensionskultur; Die Zeit- und Effizienzgewinne dieses Teils variieren in den verschiedenen hPSC-Linien erheblich. Die Reifung und Spezifizierung von Netzhautzellen in ROs erfolgt hauptsächlich im mittleren und späten Stadium der Induktion. Ohne die Zugabe von RA können reife Photorezeptoren mit sowohl reichen Zapfen als auch Stäbchen hergestellt werden.
Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, jeden Schritt quantitativ zu beschreiben und zu beschreiben, damit unerfahrene Forscher ihn wiederholen können. Verschiedene hPSC-Linien wurden durch dieses Protokoll erfolgreich in ROs induziert, mit einer robusten Ausbeute an kegelreichem Netzhautgewebe und hoher Wiederholbarkeit. HPSCs-abgeleitete ROs mit diesem Protokoll können die wichtigsten Schritte der Netzhautentwicklung in vivorekapitulieren und langfristig überleben, was nachgelagerte Anwendungen wie Krankheitsmodellierung, Arzneimittelscreening und Zelltherapie erleichtert.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem mehrstufigen netztinalen Induktionsprotokoll wurden hPSCs Schritt für Schritt geführt, um das Retinalschicksal zu erlangen, und selbstorganisiert in retinale Organoide, die laminiertes NR und RPE enthalten. Während der Differenzierung rekapitulierten hPSCs alle wichtigen Schritte der menschlichen Netzhautentwicklung in vivo, von EF, OV und RPE bis zur netztinalen Laminierung, wobei alle Subtypen von Netzhautzellen, einschließlich retinaler Ganglienzellen, amakrinen Zellen, bipolaren Zellen, Stäbch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde vom National Key R&D Program of China (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), dem Guangzhou Science and Technology Project Fund (201803010078), dem Science & Technology Project der Provinz Guangdong (2017B020230003), der Natural Science Foundation (NSF) of China (81570874, 81970842), dem Hundred Talent Program der Sun Yat-sen University (PT1001010) und den Fundamental Research Funds des State Key Laboratory of Ophthalmology unterstützt.
Materials
| (−)-Blebbistatin | Sigma | B0560-5mg | ROCK-inhibitor |
| 1 ml tips | Kirgen | KG1313 | 1 ml |
| 10 ml pipette | Sorfa | 3141001 | Pipette |
| 100 mm Tissue culture | BIOFIL | TCD000100 | 100 mm Petri dish |
| 100 mm Tissue culture | Falcon | 353003 | 100 mm Petri dish |
| 15 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011150 | Centrifuge tubes |
| 35 mm Tissue culture dishes | Falcon | 353001 | 35 mm Petri dish |
| 5 ml pipette | Sorfa | 313000 | Pipette |
| 50 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011500 | Centrifuge tubes |
| 6 wells tissue culture plates | Costar | 3516 | Culture plates |
| Anti-AP2α Antibody | DSHB | 3b5 | Primary antibody |
| ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X | Gibco | 15240062 | Antibiotic-Antimycotic |
| Anti-ISL1 Antibody | Boster | BM4446 | Primary antibody |
| Anti-Ki67 Antibody | Abcam | ab15580 | Primary antibody |
| Anti-L/M opsin Antibody | gift from Dr. jeremy | / | Primary antibody |
| Anti-PAX6 Antibody | DSHB | pax6 | Primary antibody |
| Anti-rabbit 555 | Invitrogen | A31572 | Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-Recoverin Antibody | Millipore | ab5585 | Primary antibody |
| Anti-Rhodopsin Antibody | Abcam | ab5417 | Primary antibody |
| Anti-sheep 555 | Invitrogen | A21436 | Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-SOX9 Antibody | Abclonal | A19710 | Primary antibody |
| Anti-VSX2 Antibody | Millipore | ab9016 | Primary antibody |
| B-27 supplement W/O VIT A (50X) | Gibco | 12587010 | Supplement |
| Cryotube vial | Thermo scientific-NUNC | 375418 | 1.8 ml |
| DAPI | DOJINDO | D532 | 4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max | Sigma | D2650-100ML | Multiple suppliers |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Medium |
| DMEM /F12 | Gibco | C11330500BT | Medium |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | 0.5 M PH 8.0 |
| FBS | NATOCOR | SFBE | Serum |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22μm, sterile Millex filter |
| GlutaMax, 100X | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine |
| Heparin | Sigma | H3149 | 2 mg/ml in PBS to use |
| Matrigel, 100x | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | MEM NEAA |
| mTeSR1 | STEM CELL | 85850 | hPSCs maintenance medium (MM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | Supplement |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer | GNM | GNM10010 | Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M |
| Taurine | Sigma | T0625 | Supplement |
| Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment | Corning | CLS3262-20EA | Petri dish |
References
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