Sistema de inducción organoide retiniana para la derivación de tejidos retinianas 3D a partir de células madre pluripotentes humanas
Summary
Aquí describimos un sistema optimizado de inducción organoide retiniana, que es adecuado para varias líneas de células madre pluripotentes humanas para generar tejidos retinianas con alta reproducibilidad y eficiencia.
Abstract
Las enfermedades degenerativas de la retina son las principales causas de ceguera irreversible sin un tratamiento eficaz. Las células madre pluripotentes que tienen el potencial de diferenciarse en todo tipo de células de la retina, incluso los tejidos mini-retinianas, tienen grandes promesas para los pacientes con estas enfermedades y muchas oportunidades en el modelado de enfermedades y la detección de fármacos. Sin embargo, el proceso de inducción de las hPSC a las células de la retina es complicado y requiere mucho tiempo. Aquí, describimos un protocolo de inducción retiniana optimizado para generar tejidos retinianas con alta reproducibilidad y eficiencia, adecuados para diversas células madre pluripotentes humanas. Este protocolo se realiza sin la adición de ácido retinoico, lo que beneficia el enriquecimiento de los fotorreceptores de cono. La ventaja de este protocolo es la cuantificación del tamaño de EB y la densidad de recubrimiento para mejorar significativamente la eficiencia y la repetibilidad de la inducción retiniana. Con este método, todas las principales células de la retina aparecen secuencialmente y recapitulan los principales pasos del desarrollo de la retina. Facilitará las aplicaciones posteriores, como el modelado de enfermedades y la terapia celular.
Introduction
Las enfermedades degenerativas de la retina (PR), como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) y la retinosis pigmentaria (RP), se caracterizan por la disfunción y la muerte de las células fotorreceptoras y, por lo general, conducen a una pérdida irreversible de la visión sin formas efectivas de curar1. El mecanismo subyacente a estas enfermedades es en gran parte desconocido en parte debido a la falta de modelos de enfermedades humanas2. En las últimas décadas, se han logrado avances significativos en la medicina regenerativa a través de la tecnología de células madre. Muchos investigadores, incluyéndonos a nosotros mismos, hemos demostrado que las células madre pluripotentes humanas (hPSC), incluidas las células madre embrionarias humanas (hESC) y las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC), pueden diferenciarse en todos los tipos de células retinianas, incluso en tejidos mini-retinianas a través de diversos enfoquesde diferenciación3,4,5,6,7,8,9,10, 11, proporcionando un enorme potencial en el modelado de enfermedades y la terapia celular12,13,14.
Sin embargo, el proceso de inducción de las hPSC a las células de la retina es muy complicado y requiere mucho tiempo con baja repetibilidad, lo que requiere investigadores con una rica experiencia y altas habilidades. Durante el proceso de inducción complejo y dinámico, una serie de factores afectarán el rendimiento de los tejidos de la retina15,16,17. Además, los diferentes métodos de inducción a menudo varían considerablemente en el tiempo y la expresión robusta de los marcadores retinianas, lo que podría confundir la recolección de muestras y la interpretación de datos3. Por lo tanto, un protocolo directo de diferenciación retiniana de las hPSC con orientación paso a paso estaría en demanda.
Aquí, en base a nuestros estudios publicados18,19,20,21,se describe un protocolo de inducción retiniana optimizado para generar organoides retinianas (RO) con ricos fotorreceptores de cono a partir de hPSCs, que no requiere el suplemento de ácido retinoico (AR). Este protocolo se centra en la descripción del método de varios pasos para generar retina neural y RPE. La formación de EB es la parte esencial de la etapa de inducción temprana. Tanto el tamaño como la densidad de recubrimiento de los EBs están optimizados cuantitativamente, lo que mejora científicamente el rendimiento de los tejidos de la retina y promueve la repetibilidad. En la segunda parte de la inducción, las vesículas ópticas (OVs) se autoorganizan en el cultivo de adherencia y las ROs forman en el cultivo de suspensión; los cursos de tiempo y las eficiencias de esta parte varían considerablemente en las diferentes líneas de hPSC. La maduración y especificación de las células de la retina en las OR ocurren principalmente en la etapa media y tardía de la inducción. Sin la adición de AR, se pueden producir fotorreceptores maduros con conos y bastones ricos.
El propósito de este protocolo es describir cuantitativamente y detallar cada paso para que los investigadores inexpertos lo repitan. Varias líneas de hPSC han sido inducidas con éxito en ROs por este protocolo con un rendimiento robusto de tejidos retinianas ricos en conos y alta repetibilidad. Las ROs derivadas de HPSCs con este protocolo pueden recapitular los principales pasos del desarrollo de la retina in vivoy sobrevivir a largo plazo, lo que facilita las aplicaciones posteriores, como el modelado de enfermedades, la detección de medicamentos y la terapia celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo de inducción retiniana de varios pasos, las hPSC se guiaron paso a paso para obtener el destino de la retina y se autoorganizaron en organoides retinianas que contenían NR y RPE laminados. Durante la diferenciación, las hPSC recapitularon todos los pasos principales del desarrollo de la retina humana in vivo,desde EF, OV y RPE, hasta la laminación retiniana, generando todos los subtipos de células retinianas, incluidas las células ganglionares de la retina, las células amacrinas, las cé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el Programa Nacional Clave de I + D de China (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), el Fondo de Proyectos de Ciencia y Tecnología de Guangzhou (201803010078), el Proyecto de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Guangdong (2017B020230003), la Fundación de Ciencias Naturales (NSF) de China (81570874, 81970842), el programa de talentos Hundred de la Universidad Sun Yat-sen (PT1001010) y los Fondos de Investigación Fundamental del Laboratorio Estatal Clave de Oftalmología.
Materials
| (−)-Blebbistatin | Sigma | B0560-5mg | ROCK-inhibitor |
| 1 ml tips | Kirgen | KG1313 | 1 ml |
| 10 ml pipette | Sorfa | 3141001 | Pipette |
| 100 mm Tissue culture | BIOFIL | TCD000100 | 100 mm Petri dish |
| 100 mm Tissue culture | Falcon | 353003 | 100 mm Petri dish |
| 15 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011150 | Centrifuge tubes |
| 35 mm Tissue culture dishes | Falcon | 353001 | 35 mm Petri dish |
| 5 ml pipette | Sorfa | 313000 | Pipette |
| 50 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011500 | Centrifuge tubes |
| 6 wells tissue culture plates | Costar | 3516 | Culture plates |
| Anti-AP2α Antibody | DSHB | 3b5 | Primary antibody |
| ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X | Gibco | 15240062 | Antibiotic-Antimycotic |
| Anti-ISL1 Antibody | Boster | BM4446 | Primary antibody |
| Anti-Ki67 Antibody | Abcam | ab15580 | Primary antibody |
| Anti-L/M opsin Antibody | gift from Dr. jeremy | / | Primary antibody |
| Anti-PAX6 Antibody | DSHB | pax6 | Primary antibody |
| Anti-rabbit 555 | Invitrogen | A31572 | Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-Recoverin Antibody | Millipore | ab5585 | Primary antibody |
| Anti-Rhodopsin Antibody | Abcam | ab5417 | Primary antibody |
| Anti-sheep 555 | Invitrogen | A21436 | Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-SOX9 Antibody | Abclonal | A19710 | Primary antibody |
| Anti-VSX2 Antibody | Millipore | ab9016 | Primary antibody |
| B-27 supplement W/O VIT A (50X) | Gibco | 12587010 | Supplement |
| Cryotube vial | Thermo scientific-NUNC | 375418 | 1.8 ml |
| DAPI | DOJINDO | D532 | 4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max | Sigma | D2650-100ML | Multiple suppliers |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Medium |
| DMEM /F12 | Gibco | C11330500BT | Medium |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | 0.5 M PH 8.0 |
| FBS | NATOCOR | SFBE | Serum |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22μm, sterile Millex filter |
| GlutaMax, 100X | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine |
| Heparin | Sigma | H3149 | 2 mg/ml in PBS to use |
| Matrigel, 100x | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | MEM NEAA |
| mTeSR1 | STEM CELL | 85850 | hPSCs maintenance medium (MM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | Supplement |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer | GNM | GNM10010 | Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M |
| Taurine | Sigma | T0625 | Supplement |
| Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment | Corning | CLS3262-20EA | Petri dish |
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