HiBiT Tabanlı Bir Biyoreporter Kullanılarak SARS-CoV-2 Reseptör Bağlayıcı Etki Alanı Antikorunun Tespiti
Summary
Özetlenen protokol, HiBiT-reseptör bağlayıcı etki alanı protein kompleksinin üretilmesi prosedürünü ve SARS-CoV-2 antikorlarının hızlı ve hassas tespiti için uygulanmasını açıklar.
Abstract
COVID-19 pandemisinin ortaya çıkması, şiddetli akut solunum sendromu coronavirus 2’nin (SARS-CoV-2) epidemiyolojik etkisini belirlemek için daha iyi serolojik tespit yöntemlerine olan ihtiyacı artırmıştır. SARS-CoV-2 enfeksiyonlarının sayısının artması, daha iyi antikor tespiti testlerine olan ihtiyacı artırmaktadır. Mevcut antikor algılama yöntemleri hız için hassasiyeti tehlikeye atmaktadır veya hassastır ancak zaman alıcıdır. SARS-CoV-2 nötralize edici antikorların büyük bir kısmı SARS-CoV-2’nin birincil immünojenik bölmelerinden biri olan reseptör bağlayıcı etki alanını (RBD) hedef alıyor. Sars-CoV-2 antikorlarını tespit etmek için son derece hassas, biyolüminesan etiketli bir RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) tasarladık ve geliştirdik. Aşağıdaki metinde HiBiT-RBD kompleksini üretme prosedürü ve bu aracı kullanarak RBD hedefleme antikorlarının varlığını değerlendirmek için hızlı bir test açıklanmaktadır. HiBiT-RBD protein ürününün çok çeşitli sıcaklıklar üzerindeki dayanıklılığı ve 1 saat içinde tamamlanabilen daha kısa deneysel prosedür nedeniyle, protokol hasta serum örneklerinde SARS-CoV-2 antikorlarını tespit etmek için daha verimli bir alternatif olarak düşünülebilir.
Introduction
Sars-CoV21 adlı yeni bir koronavirüsün ortaya çıkışı, 30 Mart 20212 itibarıyla 2 milyon 800 binden fazla can kaybına ve 128 milyon enfeksiyona neden oldu. SARS-CoV-2 klinik tedavileri için güvenilir ve köklü bir tedavi prosedürünün olmaması nedeniyle, daha fazla viral bulaşmayı kısıtlamak ve daha da önemlisi etkili ve sağlam bir tedavi veya aşı geliştirmek için birçok çaba yapılmıştır3. Bugüne kadar, Dünya Sağlık Örgütü tarafından bildirilen çalışmalarda 50’den fazla COVID-19 aşı adayı var4. SARS-CoV-2’ye karşı antikorların tespiti, aşının ve COVID-195’in iyileşmiş hastalarında, humoral yanıtın uzun vadeli stabilitesini belirlemek için son derece önemlidir. Bazı çalışmalar, iyileşen SARS-CoV-2 hastalarının 1 yıl sonra RBD bağlayıcı antikorların çoğunu kaybetme olasılığının olduğunu göstermiştir5,6,7,8,9. Kalıcı bağışıklığı daha iyi anlamak için daha fazla araştırma yapılması gerekir ve daha hassas antikor tespit platformları bu tür çalışmaların daha fazla yapılmasına yardımcı olabilir. Uzun süreli antikor yanıtları öneren hafif SARS-CoV-2 enfeksiyonlarının sürekli bağışıklığı raporları da ilginç ve değerli bir çalışma alanıdır. Popülasyondaki bağışıklık hakkında daha fazla bilgi sağlamak için bireylerin serasındaki antikorların izlenmesi için hızlı ve doğru bir tespit yöntemi gereklidir.
Diğer koronavirüsler gibi SARS-CoV-2 de viral ve hücre zarlarının füzyonuna yol açan olayların bir basamaklarını başlatmak için anjiyotensin dönüştürücü enzim-2’ye (ACE2) bağlanmak için çıkıntılı başak glikoproteini kullanır6,7. Son zamanlarda yapılan çeşitli çalışmalar, Spike proteininin RBD’sinin SARS-CoV28,9,10,11’e karşı güçlü ve spesifik antikor yanıtının ortaya çıkarırken çok önemli bir role sahip olduğunu kanıtlamaktadır. Özellikle, Premkumar ve ark. tarafından RBD bağlayıcı antikor titresi ile hastaların plazmasının SARS-CoV-2 nötralizasyon gücü arasında gözlenen korelasyonlar, RBD’nin virüs yapısının immünojenik bir bölmesi olmasıyla tutarlıdır9. Bunu göz önünde bulundurarak, SARS-CoV-2 antikor tespiti için mevcut birçok tanı testi zaman ve maliyet yoğundur, uzun bir kuluçka ve yıkama prosedürü gerektirir (enzime bağlı immünosorbent testi [ELISA]) veya hassasiyet ve doğruluktan yoksundur (lateral akış immünoassay [LFIA])12. Bu nedenle, YÜKSEK hassasiyet, hızlı yanıt ve nispeten düşük maliyetli COVID-19 türevi antikor tespitinin nicel ve hızlı bir tamamlayıcı serolojik yöntemi, SARS-CoV-2 epidemiyolojik gözetimi için güvenilir bir serolojik test ihtiyacına hizmet edecektir.
Toplu olarak, mevcut serolojik tahlillerin sınırlamaları, biyolüminesan raporlama sisteminin gelecekteki serosurveylerde potansiyel bir tanı ajanı olarak araştırılmasına neden oldu. Biyolüminesans, ışık emisyonu ile doğal olarak oluşan bir enzim / substrat reaksiyonudur. Nanoluc luciferaz en küçük (19 kDa), ancak Renilla ve firefly luciferase (sırasıyla 36 kDa ve 61 kDa) ile karşılaştırıldığında en parlak sistemdir 13,14. Ayrıca, Nanoluc daha önce bahsedilen sistemler arasında gürültü oranına ve stabilitesine en yüksek sinyale sahiptir. Nanoluc’un yüksek sinyal yoğunluğu, çok düşük miktarlarda muhabir füzyonlarının bile algılanmasını destekler15. Nanoluc İkili Teknolojisi (NanoBiT), nanoluc sisteminin iki segmenti olan bölünmüş bir versiyonudur: küçük BiT (11 amino asit; SmBiT) ve nispeten düşük benzeşimli etkileşimlere sahip büyük BiT (LgBiT) (KD = 190 μM) bir lüminesan kompleksi oluşturmak için16. NanoBiT, protein-protein etkileşimlerinin tanımlanmasını içeren çeşitli çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır15,17,18,19 ve hücresel sinyal yolları11,20,21.
Son zamanlarda, LGBiT’ye belirgin şekilde daha yüksek bir benzeğe sahip başka bir küçük peptit (KD = 0.7 nM), yani SmBiT yerine HiBiT Nano-Glo sistemi tanıtıldı. Nano-Glo “ekle-karıştır-oku” testinin yüksek benzeşimi ve güçlü sinyali, HiBiT’i uygun, nicel, parlak bir peptit etiketi yapar. Bu yaklaşımda, HiBiT etiketi minimum yapısal parazit uygulayan bir yapı geliştirilerek hedef proteine eklenir. HiBiT-protein füzyonu aktif olarak LgBiT muadili’ne bağlanacak ve algılama reaktiflerinin varlığında tespit edilebilir biyolüminesans üretmek için son derece aktif bir luciferaz enzimi üretecektir (Şekil 1). Benzer şekilde, SARS-CoV-2’nin kurtardığı bireylerin serasında nötralize edici antikor titresini kolayca ölçmek için HiBiT Nano-Glo tabanlı bir sistem geliştirdik ve yakın zamanda HiBiT etiketli bir SARS-CoV-2 RBD geliştirdik. Bu makalede, standart laboratuvar prosedürleri ve ekipmanları kullanılarak HiBiT-RBD biyoreporterinin üretilmesine ilişkin protokol açıklanmaktadır ve bu biyoreporterin SARS-CoV-2 RBD hedefleme antikorlarını tespit etmek için hızlı ve verimli bir testte nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
SARS-CoV-2 ile enfekte olan insan sayısının artması ve küresel aşılama için devam eden çaba, büyük ölçekli serosurveylerde kullanılabilecek hassas ve hızlı serolojik testler gerektirmektedir. Son araştırmalar, bölünmüş nanoluseferaz bazlı biyo-raporlayıcıların bu tür tahlilleri geliştirmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Yakın zamanda hasta serumunda SARS-CoV-2’ye özgü antikorları hızlı ve güvenilir bir şekilde tespit etmek için kullanılabilecek bir test tasarlamak için…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin ve Christiano Tanese De Souza’nın teknik yardımlarını takdir ve teşekkür ederiz. Mina Ghahremani’ye grafik tasarım için de teşekkür ederiz. Bu çalışma için katılan ve kan örneklerini bağışlayan tüm bireylere de teşekkür ederiz. DWC kısmen uOttawa Fakültesi ve Tıp Bölümü tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA CACACTCCTGCTATGGGTACTGC TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC TGGTGACtctggctctagcggctctggctct agcggcggcATGGTGAGCGGCTG GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC tctagcggcGACTACAAGGACC ACGACGGTGACTACAAGGACCA CGACATCGACTACAAGGACGAC GACGACAAGggcagcggctccggca gcagcggaggaggaggctctggaggagga ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc acctggacagacaggcaagatcgccgactac aactataagctgccagacgatttcaccggct gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt tgagcgggatatcagcacagagatctaccag gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc gagggccgccacatgctggagatgggccatc atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg ggtggggtggggcaggacagcaaggggga ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa agaaccagctggggctctagggggtatcccca cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg agcgagcacgtactcggatggaagccggtct tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt cggaatcgttttccgggacgccggctggatga tcctccagcgcggggatctcatgctggagt tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt tccataggctccgcccccctgacgagcatcac aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa acccgacaggactataaagataccaggcgtt tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag acacgacttatcgccactggcagcagccactg gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact acggctacactagaagaacagtatttggtatc tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac gatacgggagggcttaccatctggccccagtg ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc ggctccagatttatcagcaataaaccagccag ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg ggataataccgcgccacatagcagaactttaa aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat attattgaagcatttatcagggttattgtc tcatgagcggatacatatttgaatgtattt agaaaaataaacaaataggggttccgcgca catttccccgaaaagtgccacctgacgtc | ||
| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0.25% |
References
- Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature. Vacunas. , (2020).
- Coronavirus update (Live). Worldometer Available from: https://www.worldometers.info/coronavirus/ (2021)
- Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook. Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).
- COVID-19 vaccines. World Health Organization Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines (2021)
- Hueston, L., et al. The antibody response to SARS-CoV-2 infection. Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).
- Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Piccoli, L., et al. Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology. Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).
- Premkumar, L., et al. The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients. Science Immunology. 5 (48), (2020).
- Walls, A. C., et al. Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2. Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).
- Azad, T. Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Mol Ther. , 0074-0075 (2021).
- Bastos, M. L., et al. Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis. BMJ. 370, 2516 (2020).
- Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega Available from: https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa (2021)
- Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. A brief review of bioluminescent systems. Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).
- Nouri, K., et al. A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion. The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).
- Boute, N., et al. NanoLuc Luciferase – a multifunctional tool for high throughput antibody screening. Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).
- Nouri, K., et al. Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors. Cancers. 11 (10), 1596 (2019).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis. Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).
- Schwinn, M. K., et al. CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).
- Azad, T., et al. A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion. Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).
