Contrôle de la géométrie cellulaire par micropatterning assisté par laser infrarouge

Summary

Le protocole présenté ici permet la fabrication automatisée de micropatterns qui normalisent la forme des cellules pour étudier les structures cytosquelettiques dans les cellules de mammifères. Cette technique conviviale peut être mise en place avec des systèmes d’imagerie disponibles dans le commerce et ne nécessite pas d’équipement spécialisé inaccessible aux laboratoires de biologie cellulaire standard.

Abstract

Le micropatterning est une technique établie dans la communauté de la biologie cellulaire utilisée pour étudier les liens entre la morphologie et la fonction des compartiments cellulaires tout en contournant les complications découlant des variations naturelles de cellule à cellule. Pour normaliser la forme des cellules, les cellules sont soit confinées dans des moules 3D, soit contrôlées pour la géométrie adhésive à travers des îlots adhésifs. Cependant, les techniques traditionnelles de micropatternage basées sur la photolithographie et la gravure uv profonde dépendent fortement des salles blanches ou de l’équipement spécialisé. Nous présentons ici une technique de micropatterning assistée par laser infrarouge (microphotopatterning) modifiée à partir de Doyle et al. qui peut être facilement configurée avec des systèmes d’imagerie disponibles dans le commerce. Dans ce protocole, nous utilisons un système d’imagerie Nikon A1R MP+ pour générer des micropatterns avec une précision de micron grâce à un laser infrarouge (IR) qui abrexage les régions prédéfinies sur des lamules recouvertes d’alcool poly vinylique. Nous utilisons un script personnalisé pour permettre la fabrication automatisée de motifs avec une efficacité et une précision élevées dans les systèmes non équipés d’une mise au point automatique matérielle. Nous montrons que ce protocole de micropatterning assisté par laser IR (microphotopatterning) se traduit par des motifs définis auxquels les cellules se fixent exclusivement et prennent la forme souhaitée. En outre, les données d’un grand nombre de cellules peuvent être moyennales en raison de la normalisation de la forme des cellules. Les modèles générés avec ce protocole, combinés à l’imagerie haute résolution et à l’analyse quantitative, peuvent être utilisés pour des écrans à débit relativement élevé afin d’identifier les lecteurs moléculaires médiant le lien entre la forme et la fonction.

Introduction

La forme cellulaire est un déterminant clé des processus biologiques fondamentaux tels que la morphogenèse tissulaire^1,la migration cellulaire^2,la prolifération cellulaire³et l’expression^{génique 4.} Les changements de forme cellulaire sont entraînés par un équilibre complexe entre les réarrangements dynamiques du cytosquelette qui déforme la membrane plasmique et les facteurs extrinsèques tels que les forces externes exercées sur la cellule et la géométrie des adhérences cellule-cellule et cellule-matrice^5. Les cellules mésenchymateuses migratrices, par exemple, polymérisent un réseau dense d’actine au bord d’attaque qui pousse la membrane plasmique vers l’avant et crée une large lamellipodie^6,tandis que la contractilité de l’actomyosine rétracte le bord de fuite étroit de la cellule pour détacher la cellule de sa position actuelle^7,8. Perturber les événements de signalisation qui donnent lieu à de telles structures cytosquelettiques spécialisées perturbe la forme et la polarité et ralentit la migration cellulaire⁹. En outre, la flexion de la feuille épithéliale pendant la gastrulation nécessite une constriction apicale à base d’actomyosine qui provoque la flexion des cellules et de leurs voisins en forme de coin¹⁰. Bien que ces études soulignent l’importance de la forme cellulaire, l’hétérogénéité inhérente à la forme cellulaire a entravé les efforts visant à identifier les mécanismes qui relient la morphologie à la fonction.

À cette fin, de nombreuses approches pour manipuler la forme des cellules ont été développées au cours des trois dernières décennies. Ces approches atteignent leur objectif soit en contraignant la cellule avec un moule tridimensionnel, soit en contrôlant la géométrie d’adhésion cellulaire par dépôt à motifs de protéines de matrice extracellulaire (ECM) sur une surface antisalissure, une technique appelée micropatterning^11. Ici, nous allons passer en revue un certain nombre de techniques qui ont gagné en popularité au fil des ans.

À l’origine pionnière en tant qu’approche pour les applications microélectroniques, l’impression par microcontact à base de lithographie douce est devenue sans équivoque un favori culte¹². Une plaquette maîtresse est d’abord fabriquée en exposant sélectivement des zones d’un substrat de silicium revêtu de photorésine à la photoirradiation, laissant derrière elle une surface à motifs^13. Un élastomère, tel que PDMS, est ensuite versé sur la plaquette maîtresse pour générer un « tampon » doux qui transfère les protéines ECM vers un substrat désiré^11,14. Une fois fabriquée, une plaquette maîtresse peut être utilisée pour couler de nombreux timbres PDMS qui donnent lieu à des micropatterns hautement reproductibles^12. Cependant, les motifs ne peuvent pas être facilement ajustés en raison du long processus de photolithographie. Ce processus nécessite également un équipement hautement spécialisé et des salles blanches qui ne sont généralement pas disponibles dans les départements de biologie.

Plus récemment, il a été rapporté que l’impression directe à l’aide d’UV profonds contournait les limitations posées par les approches traditionnelles basées sur la lithographie. La lumière UV profonde est dirigée à travers un photomasque vers des zones sélectives d’une lamelle de verre recouverte de poly-L-lysine-greffé-polyéthylène glycol. Les groupes chimiques exposés aux UV profonds sont photoconvertis sans l’utilisation de linkers photosensibles pour permettre la liaison des protéines ECM^15. L’absence de linkers photosensibles permet aux lamisses à motifs de rester stables à température ambiante pendant plus de sept mois¹⁵. Cette méthode évite l’utilisation de salles blanches et d’équipement de photolithographie et nécessite une formation moins spécialisée. Cependant, l’exigence de photomasques pose toujours un obstacle important pour les expériences qui nécessitent des changements facilement disponibles dans les modèles.

En plus des méthodes qui manipulent la géométrie cellulaire par le dépôt contrôlé de protéines ECM sur une surface 2D, d’autres cherchent à contrôler la forme des cellules en enfermant les cellules dans des microstructures 3D. De nombreuses études ont adapté l’approche basée sur la lithographie douce décrite ci-dessus pour générer des chambres PDMS 3D, plutôt que 2D, afin d’étudier les processus biologiques dépendant de la forme chez les embryons, les bactéries, les levures et les plantes^16,17,18,19. La polymérisation à deux photons (2PP) a également pris les devants en tant que technique de microfabrication qui peut créer des échafaudages d’hydrogel 3D complexes avec une résolution nanométrique^{de 20.} 2PP s’appuie sur les principes de l’adsorption à deux photons, où deux photons délivrés en impulsions femtosecondes sont absorbés simultanément par une molécule – photoinitiateur dans ce cas – qui permet la polymérisation locale des photopolymères^21. Cette technique a été fortement utilisée pour imprimer des échafaudages 3D qui imitent les structures ECM natives du tissu humain et a été montré pour induire de faibles dommages photochimiques aux cellules^22.

Les débuts du microphotopatterning il y a 10 ans ont donné aux chercheurs l’occasion de fabriquer des micropatterns tout en évitant les équipements inaccessibles et spécialisés. Le microphotopatterning crée des motifs à l’échelle du micron en éliminant thermiquement les régions sélectives d’alcool poly-vinylique (PVA) recouvertes de surfaces en verre activées à l’aide d’un laser infrarouge^23,24. Les protéines ECM qui ne fixent que la surface du verre sous-jacent et non le PVA servent alors de repères biochimiques pour permettre une dynamique de propagation contrôlée et la forme des cellules. Cette méthode offre également une flexibilité supérieure car les modèles peuvent être facilement modifiés en temps réel. Ici, nous fournissons un protocole étape par étape de microphotopatterning en utilisant un système d’imagerie multi-photons commercial. Le protocole décrit est conçu pour la fabrication rapide et automatisée de grands motifs. Nous avons démontré que ces modèles contrôlent efficacement la forme des cellules en limitant la géométrie des adhérences cellule-ECM. En conclusion, nous démontrons que la technique de modelage décrite module l’organisation et la dynamique du cytosquelette d’actine.

Protocol

1. Prétraitement de coverslip Préparer des lamelle de couverture propre et grinçante comme décrit dans Waterman-Storer, 199825. Préparer la solution à 1% de (3-aminopropyl)triméthoxysilane (APTMS) et incuber les lamaux dans la solution pendant 10 min avec une agitation douce. Assurez-vous que les lamelle se déplacent librement dans la solution. Laver les lamelle deux fois avec dH2O pendant 5 min chacune. Préparer une solution de glutarald…

Representative Results

La qualité des données expérimentales obtenues par micropatterning dépend en grande partie de la qualité des modèles. Pour déterminer la qualité des motifs générés avec la méthode ci-dessus, nous avons d’abord utilisé la microscopie à réflectance pour évaluer la forme et la taille des zones photo-ablées de la lame de couverture. Nous avons constaté que chaque motif individuel ressemblait beaucoup au masque d’ablation et présentait des pensionnaires clairs et une surface qui réfléchissait uniform?…

Discussion

Les résultats ci-dessus démontrent que le protocole de micropatterning (microphotopatterning) assisté par laser IR décrit fournit des modèles adhérents reproductibles de diverses formes qui permettent la manipulation de la forme cellulaire et de l’architecture cytosquelettique. Bien que de nombreuses méthodes de micropatterning aient été développées avant et après les débuts du microphotopatterning, cette méthode présente plusieurs avantages. Tout d’abord, il ne nécessite pas d’équipement spéciali…

Materials

(3-Aminopropyl)trimethoxysilane	Aldrich	281778
10 cm Cell Culture Dish	VWR	10062-880	Polysterene, TC treated, vented
25X Apo LWD Water Dipping Objective	Nikon	MRD77225
3.5 cm Cell Culture Dish	VWR	10861-586	Polysterene, TC treated, vented
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	Thermo	62248	1mg/mL dihydrochloride solution
Bovine Serine Albumin	BioShop	ALB005
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Wisent	311-425-CL
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
Fibronectin	Sigma-Aldrich	FC010	1mg/mL in pH 7.5 buffer
Fibronectin Antibody	BD	610077	Mouse
Fiji	ImageJ		Version 1.53c
Fluorescent Phalloidin	Invitrogen	A12380	568nm
Glass Coverslip	VWR	16004-302	22 × 22 mm
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16220	25% aqueous solution
Hydrochloric Acid	Caledon	6025-1-29	37% aqueous solution
IR Laser	Coherent	Chameleon Vision
Minimal Essential Medium α	Gibco	12561-056
Mounting Medium	Sigma	F4680
Mouse Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Goat, 488nm
Multi-Photon Microscope	Nikon	A1R MP+
Myosin Light Chain Antibody	Cell Signaling Technology	3672S	Rabbit
NIS Elements	Nikon		Version 5.21.03
Nitric Acid	Caledon	7525-1-29	70% aqueous solution
Photoshop	Adobe		Version 21.2.1
Pluronic F-127	Sigma	P2443	Powder
Poly(vinyl alchohol)	Aldrich	341584	MW 89000-98000, 98% hydrolyzed
Rabbit Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4412S	Goat, 488nm
Shaker	VWR	10127-876	Alsoknown as analog rocker
Sodium Borohydride	Aldrich	452882	Powder
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	Powder
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S5011	Powder
Spyder	Anaconda	4.1.4
Trypsin	Wisent	325-042-CL	0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA