적외선 레이저 보조 마이크로패터닝을 통한 세포 지오메트리 제어
Summary
여기에 제시된 프로토콜은 포유류 세포 내의 세포골격 구조를 연구하기 위하여 세포 모양을 표준화하는 micro패턴의 자동화된 제조를 가능하게 합니다. 이 사용자 친화적 인 기술은 시판되는 이미징 시스템으로 설정할 수 있으며 표준 세포 생물학 실험실에 접근 할 수없는 특수 장비를 필요로하지 않습니다.
Abstract
Micropatterning은 자연적인 세포 대 세포 변이에서 발생하는 합병증을 우회하면서 세포 구획의 형태와 기능 사이의 연결을 연구하는 데 사용되는 세포 생물학 커뮤니티에서 확립 된 기술입니다. 세포 모양을 표준화하기 위해 세포는 3D 금형에 국한되거나 접착제 섬을 통해 접착제 형상을 제어합니다. 그러나 포토리소그래피와 딥 UV 에칭을 기반으로 하는 기존의 마이크로패턴 기술은 클린룸이나 특수 장비에 크게 의존합니다. 여기서 우리는 도일 외에서 변형된 적외선 레이저 보조 마이크로패터닝 기술(microphotopatterning)을 제시하여 시판되는 이미징 시스템으로 편리하게 설정할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 Nikon A1R MP+ 이미징 시스템을 사용하여 폴리 비닐 알코올 코팅 커버립의 사전 설정 영역을 축산하는 적외선(IR) 레이저를 통해 미크론 정밀도로 마이크로패턴을 생성합니다. 우리는 하드웨어 자동 초점이 장착되지 않은 시스템에서 고효율과 정확도로 자동화 된 패턴 제작을 가능하게하기 위해 사용자 정의 스크립트를 사용합니다. 우리는 이 IR 레이저 보조 마이크로패터닝(microphotopatterning) 프로토콜이 세포가 독점적으로 부착하고 원하는 모양을 취하는 정의된 패턴을 초래한다는 것을 보여줍니다. 더욱이, 셀 형상의 표준화로 인해 많은 수의 세포로부터의 데이터를 평균화할 수 있다. 고해상도 이미징 및 정량 분석과 결합된 이 프로토콜과 함께 생성된 패턴은 상대적으로 높은 처리량 스크린에 사용하여 형태와 기능 간의 연결을 중재하는 분자 플레이어를 식별할 수 있습니다.
Introduction
세포 형상은 조직 형태발생1,세포 이동2,세포 증식3및 유전자 발현4와같은 근본적인 생물학적 과정의 주요 결정자이다. 세포 형상의 변화는 혈장 막과 세포 세포 및 세포 매트릭스 유착의 기하학과 같은 외장 적 인자를 변형시키는 세포 골격의 동적 재배열 사이의 복잡한 균형에 의해 구동된다5. 예를 들어, 중간엽 세포를 마이그레이션하는 것은 플라즈마 멤브레인을 앞으로 밀어 내고 넓은 라멜리포디아6을생성하는 최첨단 액틴 네트워크를 중합하고, actomyosin 수축은 세포의 좁은 후행 가장자리를 후퇴시켜 현재 위치7,8에서세포를 분리한다. 이러한 특수 시토셀레탈 구조를 초래하는 신호 이벤트를 방해하여 모양과 극성을 분산시키고 세포 이동9을느리게 합니다. 또한, 위화 중에 상피 시트굽힘은 세포와 이웃이 쐐기 모양10이되는 원인이 되는 actomyosin 기반 의 정압 수축을 필요로 한다. 이 연구 결과는 세포 모양의 중요성을 강조하더라도, 세포 모양에 있는 내재된 이질성은 기능에 형태학을 연결하는 기계장치를 확인하기 위하여 노력을 방해했습니다.
이를 위해 지난 3년 동안 세포 모양을 조작하기 위한 수많은 접근법이 개발되었습니다. 이러한 접근법은 세포세포를 3차원 몰드로 제한하거나 세포외 매트릭스(ECM) 단백질의 패턴 침착을 통해 세포 부착 기하학을 제어하는 것으로 목표를 달성하며,마이크로패터닝(11)이라고불리는 기술이다. 여기에서 우리는 수년에 걸쳐 인기를 얻은 기술의 숫자를 검토합니다.
원래 마이크로 전자 응용 프로그램에 대한 접근 으로 개척, 소프트 리소그래피 기반 마이크로 접촉 인쇄는 명백하게 컬트좋아하는되고있다 12. 마스터 웨이퍼는 먼저 포토레지스트 코팅 실리콘 기판의 영역을 광조사에 선택적으로 노출시켜 패턴표면(13)을남겨두고 제작된다. PDMS와 같은 탄성중합체는 마스터 웨이퍼에 부어 ECM 단백질을 원하는기판(11,14)으로전달하는 부드러운 “스탬프”를 생성한다. 일단 제작되면 마스터 웨이퍼를 사용하여 많은 PDMS 스탬프를 캐스팅하여 매우 재현 가능한 마이크로패턴(12)을유발할 수 있습니다. 그러나 긴 포토리소그래피 프로세스로 인해 패턴을 쉽게 조정할 수 없습니다. 이 과정은 또한 생물학 부에서 일반적으로 사용할 수없는 고도로 전문화된 장비와 클린룸이 필요합니다.
최근에는 딥 UV를 이용한 직접 인쇄는 기존의 리소그래피 기반 접근법에 의해 야기되는 한계를 우회하는 것으로 보고되었습니다. 딥 UV 광은 포토마스크를 통해 폴리 L-리신-이식-폴리에틸렌 글리콜으로 코팅된 유리 커버슬립의 선택적영역으로 전달됩니다. 깊은 UV에 노출된 화학 군은 ECM단백질(15)의결합을 가능하게 하기 위해 감광성 링커를 사용하지 않고 광변환된다. 감광성 링커가 부족하여 패턴 커버립이 7개월 이상 실온에서 안정적으로 유지될 수있습니다. 이 방법은 클린룸과 포토리소그래피 장비의 사용을 방지하고 덜 전문적인 교육이 필요합니다. 그러나 포토마스크에 대한 요구 사항은 여전히 패턴의 쉽게 사용할 수 있는 변경이 필요한 실험에 상당한 장애물이 됩니다.
2D 표면에 ECM 단백질의 제어 된 증착을 통해 세포 기하학을 조작하는 방법 외에도, 다른 3D 미세 구조에 세포를 제한하여 세포 모양을 제어하는 방법을 추구한다. 많은연구는 배아, 박테리아, 효모 및 식물16,17,18,19에서모양 의존성 생물학적 과정을 조사하기 위해 2D, PDMS 챔버가 아닌 3D를 생성하기 위해 위에서 설명한 소프트 리소그래피 기반접근법을조정하였다. 2-광자 중합(2PP)은 또한 나노미터분해능(20)을가진 복잡한 3D 하이드로겔 스캐폴드를 생성할 수 있는 미세 제조 기술로 주도권을 잡았다. 2PP는 펨토초 펄스에서 전달되는 두 개의 광자가 동시에 흡수되는 2광광흡착의 원리에 의존하며, 이 경우광중합체(21)의국소 중합화를 가능하게 한다. 이 기술은 인간 조직의 네이티브 ECM 구조를 모방하는 3D 스캐폴드를 인쇄하기 위해 크게 사용되었으며세포(22)에낮은 광화학적 손상을 유도하는 것으로 나타났다.
10년 전 마이크로포토패싱의 데뷔는 연구원들에게 접근이 불가능하고 특수장비가 없는 동시에 마이크로패턴을 제작할 수 있는 기회를 제공했습니다. 마이크로포토패터닝은 적외선레이저(23,24)를이용하여 활성화된 유리 표면에 코팅된 폴리비닐 알코올(PVA)의 선택적 영역을 열적으로 제거하여 미크로톤 스케일에 패턴을 생성한다. PVA가 아닌 기본 유리 표면만을 부착하는 ECM 단백질은 제어된 확산 역학 및 세포 모양을 가능하게 하는 생화학적 단서역할을 합니다. 이 방법은 패턴을 실시간으로 쉽게 변경할 수 있기 때문에 뛰어난 유연성을 제공합니다. 여기서, 우리는 상업적다광화상 영상을 이용하여 마이크로포토패싱의 단계별 프로토콜을 제공한다. 설명된 프로토콜은 대형 패턴의 신속하고 자동화된 제조를 위해 설계되었습니다. 우리는 이러한 패턴이 세포-ECM 접착력의 형상을 제한하여 셀 모양을 효율적으로 제어한다는 것을 입증했습니다. 마지막으로, 설명된 패터닝 기술이 액틴 세포골격의 조직과 역학을 조절한다는 것을 입증합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
상기 결과는 기술된 IR 레이저 보조 마이크로패터닝(microphotopatterning) 프로토콜이 세포 형상 및 세포골격계 건축의 조작을 가능하게 하는 다양한 형상의 재현가능한 부착 패턴을 제공한다는 것을 보여준다. 마이크로포토패싱이 시작되기 전과 이후에 수많은 마이크로패턴 방법이 개발되었지만, 이 방법은 몇 가지 장점을 가지고 있다. 첫째, 일반적으로 엔지니어링 부서 내에서만 발견되는 특수 장?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 S.P.에 Connaught 기금 새로운 조사상에 의해 지원되었다, 혁신을위한 캐나다 재단, NSERC 디스커버리 보조금 프로그램 (보조금 RGPIN-2015-05114 및 RGPIN-2020-05881), 맨체스터 대학과 토론토 대학 공동 연구 기금, 토론토 XSeed 프로그램 대학. C.T.는 NSERC USRA 펠로우십의 지원을 받았습니다.
Materials
| (3-Aminopropyl)trimethoxysilane | Aldrich | 281778 | |
| 10 cm Cell Culture Dish | VWR | 10062-880 | Polysterene, TC treated, vented |
| 25X Apo LWD Water Dipping Objective | Nikon | MRD77225 | |
| 3.5 cm Cell Culture Dish | VWR | 10861-586 | Polysterene, TC treated, vented |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | Thermo | 62248 | 1mg/mL dihydrochloride solution |
| Bovine Serine Albumin | BioShop | ALB005 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Wisent | 311-425-CL | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | FC010 | 1mg/mL in pH 7.5 buffer |
| Fibronectin Antibody | BD | 610077 | Mouse |
| Fiji | ImageJ | Version 1.53c | |
| Fluorescent Phalloidin | Invitrogen | A12380 | 568nm |
| Glass Coverslip | VWR | 16004-302 | 22 × 22 mm |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16220 | 25% aqueous solution |
| Hydrochloric Acid | Caledon | 6025-1-29 | 37% aqueous solution |
| IR Laser | Coherent | Chameleon Vision | |
| Minimal Essential Medium α | Gibco | 12561-056 | |
| Mounting Medium | Sigma | F4680 | |
| Mouse Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Goat, 488nm |
| Multi-Photon Microscope | Nikon | A1R MP+ | |
| Myosin Light Chain Antibody | Cell Signaling Technology | 3672S | Rabbit |
| NIS Elements | Nikon | Version 5.21.03 | |
| Nitric Acid | Caledon | 7525-1-29 | 70% aqueous solution |
| Photoshop | Adobe | Version 21.2.1 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | Powder |
| Poly(vinyl alchohol) | Aldrich | 341584 | MW 89000-98000, 98% hydrolyzed |
| Rabbit Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4412S | Goat, 488nm |
| Shaker | VWR | 10127-876 | Alsoknown as analog rocker |
| Sodium Borohydride | Aldrich | 452882 | Powder |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | Powder |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S5011 | Powder |
| Spyder | Anaconda | 4.1.4 | |
| Trypsin | Wisent | 325-042-CL | 0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA |
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