골수 유래 마스트 세포 배양을 위한 결정성 나노셀룰로오스 내장 아가로즈 생물재료 잉크의 제조
Summary
이 프로토콜은 결정성 나노셀룰로오스(CNC)/아가로즈 복합 하이드로겔 생체재료 잉크를 마우스 골수 유래 마스트 세포와 함께 세포 표면 수용체의 세포 생존성 및 표현성 발현, 키트(CD117) 및 고친화도 이에 수용체(FcθRI)의 생체 적합성을 신속하게 평가하는 방법을 강조한다.
Abstract
3차원(3D) 바이오프린팅은 패턴으로 증착되는 하이드로겔 기반 복합체(또는 생체재료 잉크)를 활용하여 어떤 세포가 증착되는지기판으로 형성한다. 많은 생체 재료 잉크는 잠재적으로 1 차 세포에 세포 독성이 될 수 있기 때문에, 비용이 많이 드는 3D 조직 엔지니어링 프로세스에서 그들의 활용 하기 전에 이러한 하이드로겔 복합체의 생체 적합성을 결정 하는 데 필요한. 바이오프린팅을 포함한 일부 3D 배양 방법은 세포가 3D 매트릭스에 내장되어 기계적 손상을 유도하지 않고 생존력 및 바이오마커 발현의 변화를 추출하고 분석하기 어렵게 만듭니다. 이 프로토콜은 개념증명으로서, 결정성 나노셀룰로오스(CNC) 내장아가로즈 복합체의 생체 적합성을 평가하는 방법으로, 24웰 배양 시스템으로 제조되었으며, 마우스 골수 유래 마스트 세포(BMMC)는 세포 생존가능성 및 바이오마커 발현에 대한 유동 세포측정 분석법을 사용하여 한다.
CNC/아가로즈/D-매니톨 매트릭스에 18h의 노출 후, BMMC 생존력은 프로피듐 요오드(PI) 투과성에 의해 측정된 바와 같이 변경되지 않았습니다. 그러나, CNC/아가로즈/D-mannitol 기판상에서 배양된 BMMCs는 고친화 IgE 수용체(FcθRI) 및 줄기 세포 인자 수용체(Kit; CD117), 이는 바이오잉크 복합체에서 CNC의 양에 의존하는 것으로 보이지 는 않지만. BMMC의 생존가능성은 또한 3D 압출 바이오 프린터를 사용하여 피릴라 나노 셀룰로오스 (FNC)와 나트륨 알기네이트로 구성된 상업용 생체 재료 잉크에서 제조 된 하이드로겔 스캐폴드에 시간 과정 노출 에 따라 평가되었다. 6-48h의 기간 동안, FNC/alginate 기판은 유동 세포측정및 미세titer 분석(XTT 및 젖산 탈수소효소)에 의해 결정된 바와 같이 BMMC의 생존가능성에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 이 프로토콜은 마스트 세포와의 포스트 인쇄 시드를 위한 3D 스캐폴드로 유틸리티에 대한 후보 생체 재료 잉크의 생화학적 호환성을 신속하게 선별하는 효율적인 방법을 설명합니다.
Introduction
최근 3D 배양 시스템과 3D 바이오프린팅에 대한 관심은 하이드로겔 과 하이드로겔 복합재에 주목하고 있습니다. 이러한 복합체는 점성 아직 다공성 생물미약제의 역할을 하며 생물학적 조직에 필적하는 중량별 최대 99%의 수분 함량으로 구성될 수 있다1,2,3. 하이드로겔 복합재의 이러한 특징은 생존력과 기능에 영향을 미치지 않으면서 세포의 성장을 허용합니다. 이러한 복합체중 하나는 하이드로겔 복합재, 세포 스캐폴드, 2차원(2D) 및 체외세포 배양에서 보강재료로 사용되어 온 결정성 나노셀룰로오스(CNC)이다4,5. 대부분의 경우, CNC로 구성된 행렬은 인간 각막 상피 세포6, 장 상피 세포7, 인간 골수 유래 중간엽 줄기 세포8 또는 뉴런과 같은 세포9에 지나치게 세포독성이 없습니다. 그러나, 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포의 대사 활동 및 증식은 목재 계 나노셀룰로오스 복합체의 점도와 상관관계가 감소하며, 매트릭스의 조성물은 세포 기능에 대한 해로운 영향에 대해 신중하게 테스트되어야 함을 시사한다8.
유사하게, CNC는 3D 면역 세포 배양 체계에 있는 심각한 결과를 초래할 수 있던 내화시 대식세포에 있는 선동적인 반응을 유도할 수 있습니다10,11. 사실, CNC가 다른 면역 세포 반응, 특히 비만 세포에 의해 시작되는 알레르기 성 염증 반응에 영향을 미칠 수있는 방법에 사용할 수있는 데이터가 거의 없습니다. 마스트 세포는 알레르겐에 염증 반응을 활성화하는 책임이 있는 높은 친화성 IgE 수용체, FceRI를 표현하는 과립백구체입니다. 그들의 증식 및 분화는 의존형 줄기 세포 인자 (SCF), 티로신 수용체를 결합, 키트. 마스트 세포는 혈액 순환을 입력하고 이후에 모든 인간 조직에서 유비쿼터스로 분산하기 위해 말초로 이동하는 골수 전구 세포에서 파생됩니다12. 비만 세포는 3D 조직 환경에서 기능하기 때문에 체외 3D 조직 모델에서 면역 학적 과정을 연구하기위한 이상적인 면역 세포 후보입니다. 그러나, 현재까지, 비만 세포를 포함하는 시험관 내 3D 조직 모형에는 실행 가능한 없습니다.
유방 세포의 매우 민감한 특성과 외부 자극에 대한 염증 반응을 유도하는 성향으로 인해 3D 매트릭스 성분과 3D 스캐폴드로 마스트 세포를 도입하는 생체 인쇄 방법을 신중하게 고려해야 합니다. 조직 구조는 생체 재료, 즉 바이오 잉크 및 생체 재료 잉크의 두 가지 범주에서 생체 제작 될 수 있습니다. 바이오잉크는 세포가 함유된 하이드로겔 복합재이며, 생체 재료 잉크는 Groll et al.13,14에 의해 정의된 바와 같이 세포가 없는 하이드로겔 복합재라는 사실에 있습니다. 따라서 바이오잉크로 인쇄된 3D 구조에는 하이드로겔 매트릭스 내에 미리 내장된 셀이 포함되어 있는 반면, 생체 재료 잉크로 인쇄된 3D 구조는 포스트 프린팅 셀로 시드되어야 합니다. 하이드로겔 기반 바이오 잉크/생체 재료 잉크로부터의 배양 스캐폴드의 생체 제작은 압출 3D 바이오 프린터를 사용하여 가장 일반적으로 수행되며, 이는 공압 또는 기계적 으로 구동되는 피스톤14를 통해 압력을 받는 마이크로 스케일 노즐을 통해 바이오잉크/생체 재료 잉크를 압다하는 것입니다. 압출 바이오 프린터는 ‘상향식’ 접근법으로 서로 순차적으로 쌓인 2D 단면 패턴으로 바이오잉크를 증착하여 3D 스캐폴드를 제작합니다.
압출 바이오프린팅과 호환되려면 하이드로겔 기반 바이오잉크/바이오머티리얼 잉크는 티조트로픽(전단-숱이) 특성을 소지해야 하며, 이에 따라 전단 응력을 받을 때 마이크로채널 노즐을 통해 유체와 같은 생체잉크/생체재료 잉크의 성분 하이드로겔 폴리머가 구약, 젤과 같은 상태로 되돌릴 수 있으나, 전단 응력의 제거 시 젤과 같은 상태로 되돌아갑니다. . 수분 함량이 높기 때문에 하이드로겔 기반 바이오잉크/생체 재료 잉크의 폴리머는 3D 생체 인쇄 구조의 아키텍처 및 구조적 무결성을 유지하기 위해 물리적으로 또는 동적으로 교차연결되어야 합니다. 세포가 함유된 바이오잉크의 경우, 세포는 교차 연결 과정에서 화학적 스트레스를 직접 받습니다. 바이오잉크 하이드로겔 매트릭스 내에 캡슐화된 세포를 압출하는 과정은 또한 세포를 전단 응고하여 생존가능성 및/또는 세포 사멸을 감소시킬 수 있다. 일단 3D 조직 모형이 생체 인쇄되면, 하이드로겔 매트릭스 자체및 압출 및 교차 연결 프로세스에 의해 유도된 세포 독성의 수준을 구별하기 어렵다. 이것은 세포가 하이드로겔 매트릭스 안에 미리 내장되어 있는 3D 스캐폴드의 맥락에서 특히 도전적입니다, 따라서 마스트 세포의 생존에 해악할 것이다 후속 분석을 위한 세포를 제거하는 것을 어렵게 만듭니다.
마스트 세포를 포함하는 3D 조직 구조물을 생성하는 온화한 접근은 세포 배양 정지에서 미리 인쇄된, 다공성 생물 물질 잉크 3D 발판으로 세포를 종착하는 것을 관련시킵니다, 이는 말모 세포의 타고난 능력을 활용하여 말초 조직으로 순환에서 이동하는 것을 관련시킵니다. 이 세포 파종 접근법의 장점은 두 배입니다: (i) 마스트 세포는 압출 및 교차 연결 공정으로부터 전단 및 화학적 스트레스를 각각 받지 않으며, (ii) 세포는 그들의 생존가능성에 악영향을 미치지 않고 분석을 위해 부드럽게 세척하여 노출 후 3D 스캐폴드에서 쉽게 제거될 수 있다. 2D 하이드로겔 디스크가 아닌 3D 생체 인쇄, 다공성 하이드로겔 스캐폴드에서 돛대 세포의 세포 생존가능성을 파종하고 분석하는 추가적인 이점은 3D 바이오프린트 하이드로겔 스캐폴드가 대량으로 존재하지 않는 생체 내 조직의 미세 스케일 지형 특징을 회수한다는 것입니다. 이 접근법은 비용이 많이 드는 3D 조직 공학 실험에 투자하기 전에 마스트 세포뿐만 아니라 다른 면역 세포에 대한 후보 생잉크 하이드로겔 행렬의 잠재적으로 치명적인 세포 독성 효과를 결정하는 적당하고 빠르며 비용 효율적인 접근 방식입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D 생체 mimetic 조직의 제조는 세포 외 매트릭스의 구성 요소를 모방하는 바이오 잉크의 성공적인 합병을 필요로하며, 세포 구성 요소 (들)와 함께 생체 내 조직의 생리적 유사체를 생성합니다. 이것은 생리적인 생물역학 조직을 제조할 때 1 차적인 세포의 사용을 필요로 하고, 세포를 변형시키지 않습니다. 그러나 비만 세포와 같은 1차 면역학적 세포는 특히 생잉크 매트릭스 자체에 의해 유?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CNC/아가로즈/D-mannitol 매트릭스를 준비할 때 CNC와 켄 해리스, 조재영에게 기술적 조언을 해주신 알버타 이노베이트에게 감사드립니다. 우리는 또한 벤 호프만, 헤더 윈첼과 니콜 디아만타이드의 기술적 조언과 INKREDIBLE + 3D 바이오 프린터의 설정 및 교정에 대한 지원에 감사드립니다.
Materials
| A | |||
| Acetic Acid (glacial) | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| Agarose (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2125-500GM | |
| Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) | Thermo Fisher Scientific | 17-4888-82 | |
| B | |||
| b-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in | BD | 305111 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 930-186 | |
| BioLite 96 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130-191 | |
| Biosafety Cabinet Class II | Microzone Corp., Canada | BK-2-6-B3 | |
| BSA, Fraction V (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2930-100GM | |
| C | |||
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) | Thermo Fisher Scientific | 12-1171-82 | |
| CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent – Sterile Bottle 1 x 60 mL | CELLINK LLC | CL1010006001 | |
| CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare for PC | CELLINK LLC | Version 2.4.1 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G | CELLINK LLC | NZ4220005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G | CELLINK LLC | NZ4250005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G | CELLINK LLC | NZ4270005001 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) | Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| Centrifuge (Benchtop) | Eppendorf | 5804R | |
| Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 Incubator | Binder GmbH, Germany | 9040-0113 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | A00-1-1102 | |
| D | |||
| D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| F | |||
| Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352095 | |
| Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352070 | |
| FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) | Thermo Fisher Scientific | 17-5898-82 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson & Co. USA | Version 10.6.2 | |
| G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 8.4.3 | |
| H | |||
| Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) | VWR | 15170-208 | |
| HEPES Sodium Salt | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| I | |||
| Iodonitrotetrazolium chloride (INT) | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| L | |||
| L-Glutamine 200 mM (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Lithium L-lactate | Sigma Aldrich | L2250-100G | |
| M | |||
| MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) | Sigma Aldrich | M8640 | |
| Microtubes (1.7 mL clear) | Axygen | MCT-175-C | |
| Microtubes (2.0 mL clear) | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) | Millipore | ZMQS60001 | |
| N | |||
| Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) | Thermo Fisher Scientific | 725-2520 | |
| P | |||
| Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| R | |||
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) | Thermo Fisher Scientific | 12-4031-82 | |
| Recombinant Murine IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| S | |||
| Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| Sodium Azide, 500 g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| T | |||
| Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) | Sigma Aldrich | 93595 | |
| V | |||
| VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 |
References
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