骨髄由来肥満細胞培養用結晶性ナノセルロース埋め込みアガロースバイオマテリアルインクの製造
Summary
このプロトコルは、細胞の生存率および細胞表面受容体の表現型発現の観点から、マウス骨髄由来肥満細胞を有する結晶性ナノセルロース(CNC)/アガロース複合ヒドロゲル生体材料インクの生体適合性を迅速に評価する方法を強調している。
Abstract
3次元(3D)バイオプリンティングは、パターンに堆積したヒドロゲルベースの複合材料(または生体材料インク)を利用し、細胞が堆積する基質を形成します。多くの生体材料インクは原発細胞に対して細胞毒性を持つ可能性があるため、高価な3D組織工学プロセスで使用する前に、これらのヒドロゲル複合体の生体適合性を決定する必要があります。バイオプリンティングを含む一部の3D培養法では、細胞を3Dマトリックスに埋め込む必要があり、機械的損傷を引き起すことなく生存率とバイオマーカー発現の変化について細胞を抽出して分析することが困難です。本プロトコルは、細胞生存率およびバイオマーカー発現に関するフローサイトメトリックアッセイを用いて、24ウェル培養系に作製された結晶性ナノセルロース(CNC)埋め込みアガロース複合体の生体適合性を評価する方法である概念実証として説明する。
CNC/アガロース/D-マンニトールマトリックスへの18時間の曝露後、BMMCの生存率は、ヨウ化プロピジウム(PI)透過性によって測定されるように変化しなかった。しかし、 CNC/アガロース/D-マンニトール 基質上で培養されたBMMCsは、高親和性IgE受容体(FcεRI)および幹細胞因子受容体(Kit;) の発現をわずかに増加するように見えた。CD117)は、これはバイオインク複合体中のCNCの量に依存しているようには見えないが。BMMCsの生存率は、3D押出バイオプリンターを用いてフィブリラーナノセルロース(FNC)とアルギン酸ナトリウムで構成された市販の生体材料インクから製造されたヒドロゲル足場への経時暴露後にも評価された。6-48時間の期間にわたって、FNC/アルギン酸基質は、フローサイトメトリーおよびマイクロタイターアッセイ(XTTおよび乳酸脱水素酵素)によって決定されるBMMCsの生存率に悪影響を及ぼさなかった。このプロトコルは、マスト細胞を用いたポストプリントシード用の3Dスキャフォールドとして、その有用性のためのバイオマテリアルインキ候補の生化学的適合性を迅速にスクリーニングする効率的な方法を記述する。
Introduction
最近の3D培養システムと3Dバイオプリンティングへの関心は、ヒドロゲルおよびヒドロゲル複合材料に注目されています。これらの複合材料は、粘性でありながら多孔質のバイオミメティクスとして機能し、生物学的組織に匹敵する重量で最大99%の水分含有量で構成することができます1,2,3。ヒドロゲル複合材料のこれらの特徴は、それによって、その生存率および機能に影響を与えることなく細胞の増殖を可能にする。そのような複合材料の1つは、ヒドロゲル複合材料の強化材料として使用されてきた結晶性ナノセルロース(CNC)、生体材料インプラントの開発における細胞足場、および2次元(2D)および3Dインビトロ細胞培養4,5です。ほとんどの場合、CNCからなるマトリックスは、ヒト角膜上皮細胞6、腸上皮細胞7、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞8、またはニューロン様細胞9に対してあからさやかに細胞毒性を有しない。しかし、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の代謝活性および増殖は、木材ベースのナノセルロース複合体の粘度の増加との相関性が低下し、マトリックスの組成が細胞機能に及ぼす有害な影響について注意深く試験しなければならないことを示唆している8。
同様に、CNCは、3D免疫細胞培養システム10,11において重大な影響を及ぼす可能性がある、内在化時にマクロファージにおいて炎症反応を誘発する可能性がある。実際、CNCが他の免疫細胞応答、特に肥満細胞によって開始されるアレルギー性炎症反応にどのように影響を与えるかについて、利用可能なデータはほとんどありません。マスト細胞は、アレルゲンに対する炎症反応を活性化する役割を担う高親和性IgE受容体FceRIを発現するグラニュール化白血球である。それらの増殖および分化は、チロシン受容体、キットに結合する幹細胞因子(SCF)に依存している。マスト細胞は、循環に入り、その後、すべてのヒト組織に遍在的に分散するために末梢移動する骨髄前駆細胞に由来する12。マスト細胞は3D組織環境で機能するため、in vitro 3D組織モデルで免疫学的プロセスを研究するための理想的な免疫細胞候補です。しかし、現在までに、肥満細胞を含むインビトロ3D組織モデルは存在しない。
肥満細胞の高感度性と、外部刺激に対する炎症反応を引き出す傾向があるため、3Dマトリックス構成成分と3D足場にマスト細胞を導入するバイオプリンティング法を慎重に検討することが必要である。組織構築物は、バイオインクと生体材料インクの2つの大きなカテゴリーからバイオファブリケートすることができます。この違いは、バイオインクが細胞を含むヒドロゲル複合材料であるのに対し、生体材料インクはGrollららによって定義される細胞を欠くヒドロゲル複合体であるという事実にあります。したがって、バイオインクで印刷された3Dコンストラクトにはヒドロゲルマトリックス内にあらかじめ埋め込まれた細胞が含まれていますが、生体材料インクで印刷された3Dコンストラクトはポストプリンティングの細胞で播種する必要があります。ヒドロゲルベースのバイオインク/生体材料インクからの培養スキャフォールドのバイオファブリケーションは、最も一般的に、ニューマチックまたは機械的に駆動されるピストン14を介して圧力下でマイクロスケールノズルを介してバイオインク/生体材料インクを押し出す押出3Dバイオプリンタを使用して行われます。押出バイオプリンターは、「ボトムアップ」アプローチで互いに順次積み重ねられる2D断面パターンでバイオインキを堆積させることによって、3D足場を作製する。
押出バイオプリンティングと互換性を持つためには、ヒドロゲルベースのバイオインク/バイオマテリアルインクはチキソトロピック(せん断薄化)特性を有する必要があり、それによってバイオインク/生体材料インクの構成ヒドロゲルポリマーは、せん断応力を受けるとマイクロチャネルノズルを通る流体のように流れるが、シアストレスの除去時に粘性のゲル様状態に戻る必要がある。.含水率が高いため、3Dバイオプリント構造のアーキテクチャと構造的完全性を維持するために、ヒドロゲルベースのバイオインク/生体材料インクのポリマーを物理的または共有的に架橋する必要があります。細胞を含むバイオインクの場合、細胞は架橋プロセス中に直接化学ストレスを受ける。バイオインクヒドロゲルマトリックス内にカプセル化された細胞を押し出すプロセスは、細胞を剪断応力にさせ、生存率の低下および/または細胞死につながる可能性があります。3D組織モデルがバイオプリントされると、ヒドロゲルマトリックス自体によって引き出される細胞毒性のレベルと、押出および架橋プロセスをそれぞれ区別することは困難です。これは、細胞がヒドロゲルマトリックス内に事前に埋め込まれている3D足場の文脈では特に困難であり、その後の分析のために細胞を除去することは困難であり、肥満細胞の生存率に有害である。
マスト細胞を含む3D組織構築物を生成するためのより穏やかなアプローチは、細胞培養懸濁液からプレプリントされた多孔質生体材料インク3D足場に細胞を播種することを含み、肥満細胞が循環から末梢組織に移行する先天的な能力を活用する。この細胞播種アプローチの利点は、(i)マスト細胞がそれぞれ押出および架橋プロセスからせん断および化学的ストレスを受けず、(ii)細胞を分析のために穏やかに洗浄することによって3D足場から容易に除去することができる。2Dヒドロゲルディスクとは対照的に、3Dバイオプリントされた多孔質ヒドロゲル足場上のマスト細胞の細胞生存率を播種および分析する追加の利点は、3Dバイオプリントヒドロゲル足場が 生体組織の 微小地形特徴を再現することです。このアプローチは、高価な3D組織工学実験への投資に先立ち、マスト細胞および他の免疫学的細胞に対するバイオインクヒドロゲルマトリックス候補の潜在的に壊滅的な細胞毒性効果を決定するための、適切で迅速かつ費用対効果の高いアプローチです。
Protocol
Representative Results
Discussion
3Dバイオミメティック組織の製造には、細胞外マトリックスの成分を模倣するバイオインクと細胞内 組織 の生理学的類似体を作り出すバイオインクの合併が成功する必要があります。これは、生理学的バイオミメティック組織を作製する際に、原細胞の使用を必要とし、形質転換されていない細胞である。しかし、マスト細胞のような一次免疫学的細胞は、特に生体インクマトリック…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CNC/アガロース/D-マンニトールマトリックスを準備する際の技術的なアドバイスをCNCとケン・ハリスとジェヨン・チョーに提供してくれたアルバータ・イノベートに感謝します。また、INKREDIBLE+ 3Dバイオプリンターのセットアップとキャリブレーションに関する技術的なアドバイスとサポートに対して、ベン・ホフマン、ヘザー・ウィンチェル、ニコール・ディアマンタイドに感謝します。
Materials
| A | |||
| Acetic Acid (glacial) | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| Agarose (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2125-500GM | |
| Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) | Thermo Fisher Scientific | 17-4888-82 | |
| B | |||
| b-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in | BD | 305111 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 930-186 | |
| BioLite 96 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130-191 | |
| Biosafety Cabinet Class II | Microzone Corp., Canada | BK-2-6-B3 | |
| BSA, Fraction V (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2930-100GM | |
| C | |||
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) | Thermo Fisher Scientific | 12-1171-82 | |
| CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent – Sterile Bottle 1 x 60 mL | CELLINK LLC | CL1010006001 | |
| CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare for PC | CELLINK LLC | Version 2.4.1 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G | CELLINK LLC | NZ4220005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G | CELLINK LLC | NZ4250005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G | CELLINK LLC | NZ4270005001 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) | Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| Centrifuge (Benchtop) | Eppendorf | 5804R | |
| Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 Incubator | Binder GmbH, Germany | 9040-0113 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | A00-1-1102 | |
| D | |||
| D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| F | |||
| Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352095 | |
| Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352070 | |
| FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) | Thermo Fisher Scientific | 17-5898-82 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson & Co. USA | Version 10.6.2 | |
| G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 8.4.3 | |
| H | |||
| Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) | VWR | 15170-208 | |
| HEPES Sodium Salt | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| I | |||
| Iodonitrotetrazolium chloride (INT) | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| L | |||
| L-Glutamine 200 mM (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Lithium L-lactate | Sigma Aldrich | L2250-100G | |
| M | |||
| MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) | Sigma Aldrich | M8640 | |
| Microtubes (1.7 mL clear) | Axygen | MCT-175-C | |
| Microtubes (2.0 mL clear) | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) | Millipore | ZMQS60001 | |
| N | |||
| Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) | Thermo Fisher Scientific | 725-2520 | |
| P | |||
| Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| R | |||
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) | Thermo Fisher Scientific | 12-4031-82 | |
| Recombinant Murine IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| S | |||
| Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| Sodium Azide, 500 g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| T | |||
| Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) | Sigma Aldrich | 93595 | |
| V | |||
| VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 |
References
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