Summary
本协议描述了如何制作一个简单的成人 果蝇 行为观察室，以及如何通过相对简单和负担得起的方法拍摄不同类型果蝇在观察室的形态或行为的高清照片/视频。
Abstract
果蝇黑色素是 生物研究中一个非常强大的模型，但是摄影或摄像学的坏模型。本文描述了一种简单而有效的方法来观察和记录苍蝇的行为或形态。苍蝇被放置在一个半透明的观察室。15 x 5 毫米（里面没有食物）或 15 x 12 毫米（里面有一块 8 毫米高的食物）。在用紫外线 （UV）/透明滤光片覆盖后，将腔室置于 5-50 倍变焦立体显微镜下，并在显微镜两侧放置微型发光二极管 （LED） 视频灯，以照亮腔室，获得均匀、柔软、明亮且几乎无阴影的光线。然后，一台具有3-5倍光学变 ≥焦的紧凑型数码相机通过支架连接到显微镜的目镜上，并通过目镜拍摄照片或视频。通过调整变焦立体显微镜的变焦旋钮，可以非常容易地跟踪苍蝇，并根据需要拍摄全景或详细的特写图像，而相机则记录显微镜下的所有内容。因为苍蝇可以停留在室内的任何位置，因此可以从四面八方观察和记录它们。拍摄的照片或视频图像质量良好。这种方法既可用于科学研究，又可用于教学。
Introduction
嗜血杆菌是 生物学研究的杰出模型：然而，它是摄影或摄像的坏模型，因为它太小的相机或摄录一体机和太大的复合显微镜1。尽管文献中描述了出色的研究，但大多数研究只提供了模糊、不清晰的图像，而不是清晰而尖锐的照片，这些照片的细节清晰明了，说明了所描述的飞行行为。此外，尽管对苍蝇行为进行了广泛的研究（例如求爱和战斗），但这些论文大多使用插图向读者解释其研究。
本文描述了一种简单而经济的方法。使用这种方法，不仅可以观察到 果蝇 的各种行为，而且可以在立体变焦显微镜下观察到的所有细节都可以清晰而清晰地记录下来。当然，这种方法也可以用来记录苍蝇的形态，因为当它们进入睡眠或半睡眠状态时，静止模型允许用户用不同的焦点平面拍摄照片或一叠照片，从而获得更深的现场照片。这些方法可以实现没有复杂的技术和昂贵的设备，甚至精湛的手动技能。
本文的视频组件显示苍蝇的几个典型行为的视频。显示这些视频的目的有二：一是让观众知道可以捕获什么，并展示使用这种方法获得的图像质量：另一种是让对 嗜好 者感兴趣的新生，但到目前为止还没有机会通过这些清晰的视频而不是插图或模糊的图像来实际观察苍蝇的行为（如求爱、打架）。
补充视频：果蝇行为：请点击这里下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 建立观测/记录系统
注：构建飞行行为观察/记录系统所需的材料见 图1，完成的系统见 图2。系统构建和如何使用的协议如下所述。
- 做一个 fly b埃哈维奥 o服务 c汉伯 （Fboc） 。
- 获得一个 半透明（不透明） 的小型容器，使大小直径（+）15毫米×20毫米的FBOC。使用尺寸为 ±17 mm x 22 mm 的半透明塑料瓶盖制作 FBOC，或从 5 mL 移液器尖端的厚端切下 17 mm 的一段，制成 FBOC。
- 向 FBOC 倒入 1% 的黄油以调整其深度。如果食物需要放置在FBOC（参见食物的制备方法），倒入阿加以获得12毫米的深度。如果食物不需要放在FBOC，将醋倒入5毫米的深度，以便更容易地追踪果蝇的下落。
- 如果使用移液器尖端制作 FBOC，请将切断的移液器尖端部分放置在 35 mm 或 0.60 mm Petri 盘中。将 1% 的醋凝胶倒入培养皿中，厚度为 ±5 mm，等待阿加凝固，并密封 FBOC 的底部。然后，将阿加凝胶倒入 FBOC 中，达到所需的厚度。
- 在一块直径与 FBOC 直径相同的 60 mm x 60 mm x 15 mm 乙酰胺泡沫片的中心钻一个 10 毫米深的孔，从而建立 FBOC 底座。将 FBOC 插入孔中。
注：FBOC 基地保持 FBOC 稳定，防止其翻倒，并促进 FBOC 在观察和摄像过程中跟踪苍蝇的运动。 - 如有必要，用酵母介质2、人工饮食3或纯蔗糖/葡萄糖（使用1%的阿加作为凝胶剂）制作苍蝇食物，具体取决于观察目的。
- 为了直观地确定苍蝇是否在喂养，并增加苍蝇与其环境之间的对比度，在食物中加入食物染料（参见 材料表），最终浓度为12.5毫克/100mL。
注：苍蝇的腹部在喂食后立即变色。 - 将准备好的食物倒入8毫米高的培养皿中。凝固后，使用剃须刀刀片切出一块大小为 8 mm x 4 mm x 8 mm 的食物，并将其放在一块塑料上（如糖果包装）。
- 如 图3所示，将食物切成四边形金字塔或四边形圆环金字塔，以便从不同角度观察和记录苍蝇随机降落在食物上时的飞行行为。在食物下面使用塑料是防止食物中的染料扩散到FBOC的阿加。使用钳子将食物放在FBOC的中心。
- 为了直观地确定苍蝇是否在喂养，并增加苍蝇与其环境之间的对比度，在食物中加入食物染料（参见 材料表），最终浓度为12.5毫克/100mL。
- 在一些行为观察中，确保苍蝇提前饿。将 1% 的醋凝胶（1 克 agar/100 mL 水、600 微升丙酸）倒入一个厚度为 1-2 厘米的干净空瓶中，并在室温下放置 1-2 小时。将苍蝇转移到瓶子上，在 25 °C 处放置，≥36 小时。
注：苍蝇可以吸收水从阿加凝胶，所以没有必要不时添加水4，5。 - 使用吸气器将一只或多只苍蝇转移到 FBOC。如果使用吸气器是困难的，冷却和灭活在碎冰中的苍蝇，在冰袋上排序，并把它们转移到FBOC如前6所述。
注：使用冷冻大大方便了苍蝇的转移：冰冷的苍蝇可以在1分钟内恢复知觉，比那些用CO2麻醉的苍蝇快得多。虽然发冷会对苍蝇的行为产生有害影响，例如，苍蝇的交配延迟从5分7 秒增加到40分钟8，但它不会改变苍蝇的行为（如求爱行为）。因此，冷却方法可用于转移苍蝇进行一般观察（如教学实验）和摄像。然而，如果观测结果要用于科学报告，强烈建议不要让苍蝇暴露在任何麻醉中。 - 将苍蝇转移到FBOC后，用30-40毫米紫外线/透明滤光片覆盖它，让摄像机形成FBOC复合物（图4）。将FBOC复合物置于立体显微镜下进行观察。
注：为了获得清晰和清晰的图像，强烈建议使用高质量的紫外线/透明滤光片，具有高光发射（>98%）和减少耀斑。参考先前描述的一些建议 9、10：虽然没有必要购买昂贵的过滤器，但避免用玻璃覆盖FBOC，如培养皿的盖子。 - 照亮FBOC。安装迷你LED视频灯，以闪烁热鞋安装站，并把它们放在FBOC的左右两侧（图2）。打开 LED 灯，将亮度设置为 100%，颜色温度设置为 5000-5600 K。
注：迷你LED视频灯具有可调光、5600K色温，可提供均匀、明亮、近无影的照明。使用立体显微镜附带的顶部光源，LED环光照明器或光纤照明器没有产生令人满意的结果。最好使用连续电源（变压器）来照明 LED 视频灯。 - 苍蝇行为的观察和摄像
- 打开 LED 视频灯，调整立体声变焦显微镜，直到肉眼清晰可见 FBOC 的边缘。将 FBOC 移到视场的中心。
- 将通用望远镜数码相机适配器的夹子连接到立体显微镜的目镜上，然后通过交替转动相机安装螺丝和相机固定螺钉，将紧凑型数码相机牢固地连接到适配器上（图2）。
- 打开数码相机，转动水平/垂直微调旋钮，直到 FBOC 边缘清晰地出现在相机 LCD 屏幕上明亮的圆形视野的中心。将模式拨号旋转到 孔径优先自动模式， 按下多 选择器，选择 宏特写，然后按 OK 按钮。将变焦开关从广角端移到长焦端，并放大到圆形图像，直到其中央部分充满完整的 LCD 屏幕。按 电影录制 按钮开始录制（再次按下按钮以结束录制）。
注意：如果图像太暗或太亮，请按控制表盘的侧面靠近曝光补偿图标（图1），并旋转表盘以更改摄像机建议的曝光值 （EV），以达到预期效果。正电子逆向使图像更亮，负 EV 使图像变暗。图像必须是均匀的，明亮的，没有网格。 - 转动显微镜的聚焦旋钮，直到FBOC中的苍蝇清晰可见。选择感兴趣的飞行行为进行观察或视频录制。转动变焦旋钮以放大和缩小，实现所需的放大以进行观察或视频录制。
注：这种通过显微镜在显微镜下拍摄图像的方法适用于任何带眼镜的显微镜。要拍摄实验结果的照片，请使用可以以 RAW 格式拍摄的相机，因为 RAW 图像文件优于 JPEG。使用相机的液晶屏作为显示屏来观察果蝇的行为，并确保立体变焦显微镜具有至少 5-50 倍的变焦。
2. 观察和摄像飞行行为的议定书
- 准备苍蝇
- 在 25 °C 的玉米粉介质上培养苍蝇，湿度为 60%，光/暗周期为 12 小时。在孵化后6天内收集苍蝇进行观察（求爱和战斗行为除外）。
注：这里，介质由1000mL水，105克玉米粉，75克蔗糖，15克琼脂，40克酵母粉，28mL 10%甲基对羟基苯甲酸酯（w/v在95%乙醇），和6.25mL丙烯酸组成。
- 在 25 °C 的玉米粉介质上培养苍蝇，湿度为 60%，光/暗周期为 12 小时。在孵化后6天内收集苍蝇进行观察（求爱和战斗行为除外）。
- 通过发冷从麻醉中恢复知觉
- 像以前描述的那样冷却苍蝇。6 使用钳子将 嗜好者 从冰盒转移到 FBOC。在视频中记录苍蝇从不活动到正常姿势的过程。
- 飞睡眠、喂食、排泄和社交行为
- 饿死飞行36小时。将4-6只果蝇用染色食品转移到FBOC。在视频中观察和记录飞行行为。
注意：保持一动不动超过5分钟的苍蝇显示睡眠行为11。嗜血杆菌可以睡在食物上或垂直的FBOC墙上（身体垂直于观察室壁）。虽然睡觉时身体不动，但腹部可以看出起伏。喂食行为表现在苍蝇伸展其前体，在不断吮吸时在食物上移动，其腹部变蓝。在集体喂养或其他活动中，果蝇伸展双脚，友好地触摸其他果蝇的身体。这是一种社会行为。
- 饿死飞行36小时。将4-6只果蝇用染色食品转移到FBOC。在视频中观察和记录飞行行为。
- 飞行梳妆行为
- 冷却苍蝇描述6。将冷冻苍蝇扔进阿加粉中，然后用阿加粉卷起来盖住它们。将苍蝇转移到FBOC。观察和记录梳妆行为。
注：当果蝇从冰冻中恢复知觉时，它会迅速从体内脱落阿加粉，用腿12、13清洁身体的每一个部位。在喂养、求爱和其他行为中也可以看到梳妆行为。
- 冷却苍蝇描述6。将冷冻苍蝇扔进阿加粉中，然后用阿加粉卷起来盖住它们。将苍蝇转移到FBOC。观察和记录梳妆行为。
- 飞行求爱和战斗行为
- 收集雌蝇和雄蝇如前所述7。为了观察苍蝇的求爱行为，将雌蝇和雄蝇放入FBOC观察并记录6种求爱（成功和失败）行为。
- 为了观察苍蝇的战斗行为，将两只雄性放入FBOC。观察并记录他们互相推挤的行为。
- 飞蛋行为
- 准备雌性苍蝇如前所述5。将4只雌性苍蝇带食物进入FBOC。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
通过紫外线过滤器拍摄清晰而清晰的图像
执行一个简单的实验，观察紫外线过滤器和普通玻璃在实验室中的区别。取一个苍蝇培养瓶，取下塞子，把它放在立体解剖显微镜下，用紫外线过滤器和Petri菜盖（交替）盖住它。在这两个案中拍摄的照片显示在图5中。通过紫外线过滤器拍摄的照片清晰而清晰，与未覆盖文化小瓶时拍摄的照片非常相似。通过佩特里菜的玻璃拍摄的照片的质量非常差，即使焦点是准确的。普通玻璃（或丙烯酸板）不涂层，最高透射率为92%14、15，带多层涂层的透明/紫外线滤光片的透光率为98-99%。
因此，通过普通玻璃（或丙烯酸板）拍摄的图像不如通过透明/紫外线滤镜拍摄的图像清晰。普通玻璃的另一个重要缺陷，如实验室盘的盖子，是其表面不均匀。图 5 中可以看到，由于玻璃表面不均匀，照片的一部分清晰，部分模糊。因此，应使用透明/紫外线过滤器，而不是使用普通玻璃或丙烯酸板来覆盖FBOC。本协议中使用的紫外线过滤器（图5）价格便宜（10欧元），无品牌，其光传输未知。换句话说，即使它是一种廉价的紫外线过滤器，通过它捕获的图像可能比通过普通玻璃捕获的图像清晰得多。
质量好，设备贵
飞行行为是用JPEG专用相机记录的，该相机的传感器要小得多（1/2.3'）。视频分辨率为 1920 x 1080 像素 （在 30 frames per 的生态， fps）;这部电影的质量令人满意。廉价的紫外线过滤器用于覆盖 FBOC，立体变焦显微镜没有品牌。LED 灯（例如 GODOX LED-p120）的成本约为 70 美元（参见 材料表）。换言之，所使用的设备非常经济：然而，视频质量很好，清楚地显示了苍蝇的一些行为，如求爱和战斗的全景，以及一些行为的细节，如排泄物和排泄物。换句话说，即使它是一种廉价的紫外线过滤器，通过它捕获的图像可能比通过普通玻璃捕获的图像更清晰、更清晰。
图6是从录像中拍摄的照片，显示苍蝇身体每个部位的细节。显然，使用具有更高图像质量的相机和立体显微镜将产生图像质量较高的视频或照片。如果相机的帧速率为 ≥60 fps，图像质量良好，则可以通过大量动作或动作更清晰地捕捉更多细节。该系统的另一个优点是，由于相机连接到变焦立体显微镜，因此使用变焦系统从全景拍摄到特写镜头非常容易。
全方位录制
观察和摄像通常从顶部完成：然而，由于苍蝇可以停留在FBOC的任何部分：垂直的FBOC壁，倾斜的食物表面，甚至紫外线过滤器（腹部朝上），它们的身体垂直于这些表面，它们的行为可以从多个视角观察和记录。例如，在 图7 中可以清楚地看到，雌蝇在产卵过程中经常用后腿摩擦卵泡。从侧面5看不清产蛋行为的这个细节。
图1：用于构建飞行行为观察和记录系统的摄影器材和其他配件。 缩写：LED = 发光二极管。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：嗜血者行为观察和记录系统。请点击这里查看此图的较大版本。
图3：食物大小和形状的插图。请点击这里查看此图的较大版本。
图4：FBOC综合体的插图。 缩写：FBOC = 飞行行为观察室。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：通过紫外线过滤器拍摄的照片，通过实验室Petri盘的盖子，直接拍摄，没有任何封面。请点击这里查看此图的较大版本。
图6：从录像中拍摄的图像。请点击这里查看此图的较大版本。
图7：观察果蝇产卵行为的异常视角。请点击这里查看这个数字的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
光是摄影和摄像的核心，是获得高质量图像的决定性因素。在这里，两个可调亮度和色温的LED视频灯被用作照明器，并选择了半透明材料来制造FBOC。两侧的 LED 灯板提供足够的亮度，半透明材料软化和散射光，最终产生均匀、柔和和明亮的光线来照亮 FBOC 中的苍蝇，而不会产生令人不快的过度曝光或曝光不足区域。无需精密且昂贵的照明设备即可实现理想的照明。在这里，使用的紫外线/透明滤光片具有非常高的光发射和低反射，以覆盖FBOC，光损失非常小。这些措施确保了清晰明了的图像。
我们通过支架将数码相机连接到立体变焦显微镜的目镜上，并通过目镜拍摄照片或视频。在显微镜下可以观测到的所有图像都可以被记录下来。通过旋转对焦按钮和抬起显微镜，很容易在 FBOC 的狭窄空间内跟踪苍蝇，并根据需要放大或缩小以记录本地详细信息或总体动态，而使用录像机或摄像机直接拍摄 FBOC 的摄像机是无法实现的。同时，相机可以根据图像质量要求进行选择。事实上，数码相机可以通过支架连接到任何带有目镜的显微镜。多年来，本文的相应作者已经成功地以这种方式记录了实验结果。
用于记录果蝇行为的紧凑型数码相机必须具有 3-5 倍光学变焦（数字变焦不应用于视频录制）。这些摄像机的长焦端（+100 mm 焦距）用于将视野中心的图像放大到整个屏幕，以便获得的最终图像是一个愉快的图像，周围没有导航。如果相机只有广角固定对焦镜头，或光学变焦镜头超过 7 倍，则捕获的图像周围将或多或少出现令人不快的浏览。数字单镜头反射相机和摄录一体机都不适合本文中描述的方法。摄像机必须能够以 30 fps 的分辨率录制分辨率至少为 1080 P 的视频。如果相机不能通过连续电源供电，则必须购买更多的备用电池才能随时更换。
苍蝇可以站在飞机上的任何角度，他们的身体是垂直于这个表面。即使睡觉时，他们也可以一动不动地站在垂直文化瓶壁上。因此，从上到下拍摄时，只要我们以适当的角度为他们提供平面，就可以全方位观察和拍摄果蝇的行为，而无需从FBOC的一侧拍摄其行为。这就是四角食品金字塔设计的原因。
但是，在这个系统中，相机不能对焦并锁定苍蝇，并在苍蝇穿过帧时自动拍摄。实验者必须始终使用立体显微镜的对焦和缩放功能来跟踪苍蝇的拍摄。正因如此，FBOC的直径应该很小，FBOC的深度应该很浅，这样实验者才能快速跟踪移动的果蝇。有些行为可能需要记录在黑暗的17，18。本文没有讨论飞行行为的这些方面。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢李向东教授和摄影家程静先生所做的有益的讨论和建议。这项工作得到了中国农业大学生命科学实验教学示范中心探索项目（20200101）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| compact camera, Nikon P310 | Nikon | 3-5x optical zoom, cam record 1080 P HD video | |
| ethylamine foam | 60 mm x 60 mm x 15 mm | ||
| Food Blue No 1 | CAS 3844-45-9 | ||
| mini LED lights and transformer | GODOX | LED-P120 | have 5000-5600 K color temperature |
| small container (e.g. bottle cap) | about Ø 15 mm x 20 mm | ||
| UV / Clear filter | high-quality UV/Clear filter with high transmittance, 30-40 mm | ||
| zoom stereo microscope | 5-50x zoom |
References
- Chyb, S., Gompel, N. Atlas of Drosophila morphology: Wild-type and classical mutants. , Academic Press. (2013).
- Yang, D. Carnivory in the larvae of Drosophila melanogaster and other Drosophila species. Scientific Reports. 8, 15484 (2018).
- Piper, M. D., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nature Methods. 11, 100-105 (2014).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of visualized experiments : JoVE. (3), e193 (2007).
- Yang, C. -H., Belawat, P., Hafen, E., Jan, L. Y., Jan, Y. -N. Drosophila egg-laying site selection as a system to study simple decision-making processes. Science. 319 (5870), 1679-1683 (2008).
- Yang, D. Simple homemade tools to handle fruit flies-Drosophila melanogaster. Journal Of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59613 (2019).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3795 (2012).
- Barron, A. B. Anesthetizing Drosophila for behavioural studies. Journal of Insect Physiology. 46 (4), 439-442 (2000).
- Cicala, R. My not quite complete protective filter article. , Available from: https://www.lensrentals.com/blog/2017/06/the-comprehensive-ranking-of-the-major-uv-filters-on-the-market (2017).
- Carnathan, B. UV and clear lens protection filters review. , Available from: https://www.the-digital-picture.com/Reviews/UV-and-Clear-Lens-Protection-Filters.aspx (2013).
- Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
- Barradale, F., Sinha, K., Lebestky, T.
- Szebenyi, A. L.
- Arkema Inc. Plexiglas : optical and transmission characteristics. , Available from: https://www.plexiglas.com/export/sites/plexiglas/.content/medias/downloads/sheet-docs/plexiglas-optical-and-transmission-characteristics.pdf (2000).
- Fluegel, A. Calculation of the light reflection and transmission. , Available from: https://www.glassproperties.com/reflection/ (2007).
- Hunter, F., Biver, S., Fuqua, P. Light science & magic: an introduction to photographic Lighting. , Routledge. (2015).
- Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
- Rieger, D., et al. The fruit fly Drosophila melangaster favors dim light and times its activity peaks to early dawn and late dusk. Journal of Biological Rhythms. 22 (5), 387-399 (2007).
