Modélisation de l’AVC chez la souris: lésions corticales focales par photothrombose
Summary
Décrit ici est le modèle d’AVC photothrombotique, où un AVC est produit à travers le crâne intact en induisant une occlusion microvasculaire permanente à l’aide d’un éclairage laser après administration d’un colorant photosensible.
Abstract
L’AVC est l’une des principales causes de décès et d’invalidité acquise chez les adultes dans les pays développés. Malgré des recherches approfondies pour de nouvelles stratégies thérapeutiques, il reste des options thérapeutiques limitées pour les patients victimes d’un AVC. Par conséquent, davantage de recherches sont nécessaires pour les voies physiopathologiques telles que l’inflammation post-AVC, l’angiogenèse, la plasticité neuronale et la régénération. Compte tenu de l’incapacité des modèles in vitro à reproduire la complexité du cerveau, les modèles expérimentaux d’AVC sont essentiels pour l’analyse et l’évaluation ultérieure de nouvelles cibles médicamenteuses pour ces mécanismes. En outre, des modèles standardisés détaillés pour toutes les procédures sont nécessaires de toute urgence pour surmonter la crise dite de la réplication. Dans le cadre d’un effort au sein du consortium de recherche ImmunoStroke, un modèle murin photothrombotique standardisé utilisant une injection intrapéritonéale de Rose Bengal et l’éclairage du crâne intact avec un laser de 561 nm est décrit. Ce modèle permet la performance de l’AVC chez la souris avec une allocation à n’importe quelle région corticale du cerveau sans chirurgie invasive; permettant ainsi l’étude de l’AVC dans diverses zones du cerveau. Dans cette vidéo, les méthodes chirurgicales d’induction de l’AVC dans le modèle photothrombotique ainsi que l’analyse histologique sont démontrées.
Introduction
L’AVC ischémique reste l’une des principales causes de décès et d’invalidité acquise chez les adultes dans les paysdéveloppés au 21e siècle, représentant environ 2,7 millions de décès en 2017 dans le monde1. Malgré les immenses efforts de la communauté scientifique, peu de traitements sont disponibles. De plus, avec des critères d’exclusion aussi élevés, ces options déjà limitées ne sont pas accessibles à de nombreux patients, ce qui entraîne un besoin urgent de nouveaux traitements pour améliorer la récupération fonctionnelle après un AVC.
Compte tenu de l’incapacité des modèles in vitro à reproduire les interactions complexes du cerveau, les modèles animaux sont essentiels pour la recherche préclinique sur les accidents vasculaires cérébraux. Les souris sont le modèle animal le plus fréquemment utilisé dans le domaine de la recherche sur les accidents vasculaires cérébraux. La majorité de ces modèles murins visent à induire des infarctus en bloquant le flux sanguin dans l’artère cérébrale moyenne (ACM) puisque la majorité des lésions humaines d’AVC sont situées dans le territoire du MCA2. Bien que ces modèles récapitulent mieux les lésions d’AVC humain, ils impliquent des chirurgies convulsées avec une variabilité élevée du volume de l’infarctus.
Depuis la proposition de Rosenblum et El-Sabban du modèle photothrombotique en 19773,et plus tard l’application de ce modèle aux rats Watson et al.4,il est devenu largement utilisé dans la recherche sur l’AVC ischémique5,6. Le modèle d’AVC photothrombotique induit un infarctus cortical local et défini à la suite de la photoactivation d’un colorant sensible à la lumière préalablement injecté dans le flux sanguin. Cela provoque une thrombose locale des vaisseaux dans les zones exposées à la lumière. En bref, lors de l’exposition à la lumière du colorant photosensible injecté, une lésion oxydative localisée de la membrane cellulaire endothéliale est induite, entraînant une agrégation plaquettaire et la formation de thrombus, suivies d’une perturbation locale du flux sanguin cérébral7.
Le principal avantage de cette technique réside dans sa simplicité d’exécution et la possibilité de diriger la lésion vers la région souhaitée. Contrairement à d’autres modèles expérimentaux d’AVC, une expertise chirurgicale mineure est nécessaire pour effectuer le modèle d’AVC photothrombotique car la lésion est induite par l’éclairage du crâne intact. De plus, les bordures bien délimitées(Figure 2A et Figure 5B)et la flexibilité pour induire la lésion à une région spécifique du cerveau peuvent faciliter l’étude des réponses cellulaires au sein de l’aire ischémique ou corticale intacte8. Pour ces raisons, cette approche convient à l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires de la plasticité corticale.
Au cours des dernières décennies, l’inquiétude croissante concernant le manque de reproductibilité entre les groupes de recherche a été appelée la crise dite de la réplication9. Après la coordination de la première étude préclinique randomisée contrôlée multicentrique en 201510, un outil proposé pour améliorer la recherche préclinique11 , 12,13, il a été confirmé que l’une des causes de l’échec de la reproductibilité entre les études précliniques de laboratoires indépendants était le manque de normalisation suffisante des modèles expérimentaux d’AVC et des paramètres de résultats14. Par conséquent, lorsque le consortium ImmunoStroke a été créé (https://immunostroke.de/), une collaboration qui vise à comprendre les interactions cerveau-immunité sous-jacentes aux principes mécanistes de la récupération de l’AVC, la normalisation de tous les modèles expérimentaux d’AVC entre chaque groupe de recherche était essentielle.
La procédure normalisée pour l’induction du modèle photothrombotique telle qu’utilisée dans le consortium de recherche susmentionné est décrite ici. Brièvement, un animal a subi des anesthésiques, a reçu une injection de Rose Bengal (10 μL / g) par voie intrapéritonale, et le crâne intact, à 3 mm à gauche de bregma, a été immédiatement éclairé par un laser de 561 nm pendant 20 min(Figure 1). En outre, une méthode histologique et comportementale connexe pour analyser le résultat de l’AVC dans ce modèle est rapportée. Toutes les méthodes sont basées sur des procédures opérationnelles normalisées développées et utilisées en laboratoire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté décrit le modèle expérimental de photothrommose par AVC en éclairant le crâne intact avec un laser de 561 nm, avec une injection intrapéritonéale précédente de Rose Bengal. Jusqu’à récemment, l’utilisation de ce modèle était faible mais ne cesse d’augmenter.
La mortalité pendant l’induction de l’AVC dans ce modèle est absente. La mortalité globale de moins de 5% survient pendant l’opération en raison de complications anesthésiologiques ou d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions tous nos partenaires de collaboration des consortiums Immunostroke (FOR 2879, From immune cells to stroke recovery) pour leurs suggestions et discussions. Ce travail a été financé par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) dans le cadre de la stratégie d’excellence de l’Allemagne dans le cadre du Cluster de Munich pour la neurologie des systèmes (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198) et dans le cadre des subventions LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 et LL-112/1-1.
Materials
| 561 nm wavelenght laser | Solna | Cobolt HS-03 | |
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit | Millipore | S7100 | |
| Bepanthen pomade | Bayer | 1578681 | |
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Collimeter | Thorlabs | F240APC-A | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filter paper | Macherey-Nagel | 432018 | |
| Fine Scissors | FST | 15000-00 | |
| Forceps | FST | 11616-15 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | 40-90-8D | |
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Speckle | Perimed | PeriCam PSI HR | |
| Mayor Scissors | FST | 1410-15 | |
| Phosphate Buffered Saline PH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Protective glasses | Laser 2000 | NIR-ZS2-38 | |
| Rose Bengal | Sigma Aldrich | 198250-5G | |
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereotactic frame | Stoelting | 51500U | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Xylacine | Albrecht |
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