利用 体内 出生后电穿孔研究小脑颗粒神经元形态和突触发育
Summary
在这里，我们描述了一种方法，当这些细胞细化其突触结构并形成突触以整合到整个脑回路中时，在出生后大脑发育的时间过程中可视化小鼠小脑中颗粒神经元的突触发生。
Abstract
神经元在大脑发育过程中经历其结构和功能的动态变化，以与其他细胞形成适当的连接。啮齿动物小脑是跟踪单细胞类型小脑颗粒神经元（CGN）随时间变化的发育和形态发生的理想系统。在这里，发育中的小鼠小脑中颗粒神经元祖细胞的 体内 电穿孔用于稀疏标记细胞以进行随后的形态学分析。该技术的功效体现在它能够展示CGN成熟的关键发育阶段，特别关注树突爪的形成，树突爪是这些细胞接收大部分突触输入的特殊结构。除了在整个小脑发育过程中提供CGN突触结构的快照外，该技术还可以适应以细胞自主的方式对颗粒神经元进行遗传操作，以研究任何感兴趣的基因的作用及其对CGN形态，爪发育和突触发生的影响。
Introduction
大脑发育是一个从胚胎发生到出生后生命的漫长过程。在此期间，大脑整合了内在和外在刺激的组合，这些刺激塑造了树突和轴突之间的突触连接，最终指导行为。啮齿动物小脑是研究突触如何发展的理想模型系统，因为单个神经元类型的小脑颗粒神经元（CGN）的发育可以在从祖细胞过渡到成熟神经元时进行跟踪。这部分是由于大多数小脑皮层在出生后发育，这使得出生后易于遗传操作和细胞标记1。
在哺乳动物中，CGN分化始于胚胎发育结束时，当时后脑中的增殖细胞子集迁移到菱形唇上，在小脑表面形成次级生发区2，3，4。尽管它们完全致力于颗粒神经元祖细胞（GNP）身份，但这些细胞继续在外部颗粒层（EGL）的外部增殖，直到出生后第14天（P14）。这一层的增殖导致小脑的大规模扩张，因为这些细胞只产生CGNs5。一旦新生的CGN退出EGL中的细胞周期，它们就会向内迁移到内部颗粒层（IGL），留下一个轴突，该轴突将在小脑的分子层中分叉并行进，形成平行纤维，突触到浦肯野细胞上6。这些纤维在分子层中的位置取决于细胞周期退出的时间。
首先分化的CGN将其平行纤维留向分子层的底部，而分化的CGN的轴突聚集在顶部7，8。一旦CGN细胞体到达IGL，它们就开始细化树突并与附近的抑制性和兴奋性神经元形成突触。CGN的成熟树枝状树表现出具有四个主要过程的刻板结构。在CGN成熟过程中，这些树突末端的结构形成一个爪子，该爪子富含突触后蛋白9，10。这些称为树突爪的特殊结构包含颗粒神经元上的大部分突触，对于接收来自脑桥的苔藓纤维神经支配的兴奋性输入以及来自局部高尔基体细胞的抑制性输入非常重要。一旦完全配置，CGN的突触连接允许这些细胞将输入从小脑前核中继到浦肯野细胞，浦肯野细胞从小脑皮层投射到小脑深部核。
GNPs的出生后体内电穿孔优于其他基于标记的方法，例如病毒感染和转基因小鼠系的产生，因为可以在快速的时间轴上实现所需构建体的表达，并且该方法针对少量细胞群，可用于研究细胞自主效应。该方法已在先前的研究中用于研究CGN的形态发育;然而，这些研究集中在单个时间点或短时间窗口9，10，11，12，13。该标记方法与图像分析相结合，以记录出生后前三周CGN分化的整个时间过程中发生的CGN形态变化。这些数据揭示了中广核树突发育的动态，这是小脑回路构建的基础。
Protocol
注意：所有程序均根据杜克大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的协议进行。 1. 体内电穿孔或 IVE 的 DNA 制备（术前 1 天） 收集以下材料：纯化的DNA（每只动物0.5-25μg），3M乙酸钠，乙醇，固绿染料，超纯蒸馏水，磷酸盐缓冲溶液（PBS）（见材料表）。注意：对于DNA，从Addgene（FUGW，https://www.addgene.org/14883/）获得在人泛素启动子下表达绿色荧光?…
Representative Results
图4：小脑发育过程中颗粒神经元形态分析。 （A） 从3DPI到14DPI（出生后年龄P10至P21）、细胞核（蓝色）和GFP（绿色）的电穿孔CGN的最大投影图像;箭头表示单个树突，比例尺为10μm。 （B）树突的平均数量。（C）从体细胞基部到枝晶尖端测量的平均枝晶长度。（…
Discussion
小脑颗粒神经元是哺乳动物大脑中最丰富的神经元，几乎占啮齿动物大脑中神经元总数的60-70%1，14。小脑已被广泛用于阐明细胞增殖、迁移、树突形成和突触发育的机制6，9，10，11，15，16，17，18，<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了NIH资助R01NS098804（A.E.W.），F31NS113394（U.C.）和杜克大学夏季神经科学项目（D.G.）的支持。
Materials
| Betadine | Purdue Production | 67618-150-17 | |
| Cemented 10 µL needle | Hamilton | 1701SN (80008) | 33 gauge, 1.27 cm (0.5 in), 4 point style |
| Chicken anti-GFP | Millipore Sigma | AB16901 | Our lab uses this antibody at a 1:1000 concentration |
| Cotton-tip applicator | |||
| Donkey anti-chicken Cy2 | Jackson ImmunoResearch | 703-225-155 | Our lab uses this antibody at a 1:500 concentration |
| Ethanol (200 proof) | Koptec | V1016 | |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| FUGW plasmid | Addgene | 14883 | |
| Glass slides | VWR | 48311-703 | Superfrost plus |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Heating pad | Softheat | ||
| Hoescht 33342 fluorescent dye | Invitrogen | 62249 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Micro cover glass | VWR | 48382-138 | |
| Nail polish | Sally Hansen | Color 109 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| O.C.T. embedding compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Olympus MVX10 Dissecting Scope | Olympus | MVX10 | |
| P200 pipette reach tip | Fisherbrand | 02-707-138 | Used for needle spacer |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS pH 7.4 (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| Simple Neurite Tracer | FIJI | https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_ Instructions |
|
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Surgical tools | RWD Life Science | Small scissors and tweezers | |
| Triton X-100 | Roche | 11332481001 | non-ionic detergent |
| Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 | 5 mm, platinum plated tweezer-type electrodes |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Vectashield mounting media | Vectashield | H1000 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Zeiss 780 Upright Confocal | Zeiss | 780 |
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Cite This Article
Chan, U., Gautam, D., West, A. E. Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development. J. Vis. Exp. (172), e62568, doi:10.3791/62568 (2021).