Chirurgie en monsterverwerking voor correlatieve beeldvorming van de muriene longklep
Summary
Hier beschrijven we een correlatieve workflow voor de excisie, druk, fixatie en beeldvorming van de muriene longklep om de bruto-conformatie en lokale extracellulaire matrixstructuren te bepalen.
Abstract
De onderliggende oorzaken van hartklepgerelateerde ziekte (HVD) zijn ongrijpbaar. Murine diermodellen bieden een uitstekend hulpmiddel voor het bestuderen van HVD, maar de chirurgische en instrumentale expertise die nodig is om de structuur en organisatie nauwkeurig te kwantificeren over meerdere lengteschalen heeft de vooruitgang belemmerd. Dit werk biedt een gedetailleerde beschrijving van de muriene dissectie, en bloc kleuring, monsterverwerking en correlatieve beeldvormingsprocedures voor het weergeven van de hartklep op verschillende lengteschalen. Hydrostatische transvalvulaire druk werd gebruikt om de temporele heterogeniteit te beheersen door de hartklepconformatie chemisch te bevestigen. Micro-computertomografie (μCT) werd gebruikt om de geometrie van de hartklep te bevestigen en een referentie te geven voor de downstream monsterverwerking die nodig is voor de seriële blokkoping elektronenmicroscopie (SBF-SEM). Seriële SEM-beelden met hoge resolutie van de extracellulaire matrix (ECM) werden genomen en gereconstrueerd om een lokale 3D-weergave van de organisatie te bieden. μCT- en SBF-SEM-beeldvormingsmethoden werden vervolgens gecorreleerd om de ruimtelijke variatie over de longklep te overwinnen. Hoewel het gepresenteerde werk uitsluitend op de longklep is, kan deze methodologie worden gebruikt voor het beschrijven van de hiërarchische organisatie in biologische systemen en is cruciaal voor de structurele karakterisering over meerdere lengteschalen.
Introduction
De longklep (PV) dient om eenrichtingsbloeding tussen de rechterventrikel en de longslagader te garanderen. Longklepmisvormingen worden geassocieerd met verschillende vormen van aangeboren hartaandoeningen. De huidige behandeling voor aangeboren hartklepziekte (HVD) is valvulaire reparatie of klepvervanging, die meerdere invasieve operaties gedurende de hele levensduur van een patiënt kan vereisen1. Het is algemeen aanvaard dat de functie van de hartklep is afgeleid van de structuur, vaak aangeduid als de structuur-functie correleren. Meer specifiek bepalen de geometrische en biomechanische eigenschappen van het hart zijn functie. De mechanische eigenschappen worden op hun beurt bepaald door de samenstelling en organisatie van de ECM. Door een methode te ontwikkelen voor het bepalen van de biomechanische eigenschappen van muriene hartkleppen, kunnen transgene diermodellen worden gebruikt om de rol van het ECM op de hartklepfunctie en disfunctie2,3,4,5te ondervragen.
Het muriene diermodel wordt al lang beschouwd als de standaard voor moleculaire studies omdat transgene modellen gemakkelijker beschikbaar zijn bij muizen in vergelijking met andere soorten. Murine transgene modellen bieden een veelzijdig platform voor het onderzoeken van hartklep-gerelateerde ziekten6. De chirurgische expertise en instrumentatievereisten om zowel de geometrie als de ECM-organisatie te karakteriseren, zijn echter een belangrijke hindernis geweest bij het voortgang van HVD-onderzoek. Hstologische gegevens in de literatuur geven een beeld van het extracellulaire matrixgehalte van de muriene hartklep, maar alleen in de vorm van 2D-afbeeldingen, en kunnen de 3D-architectuur7,8niet beschrijven . Bovendien is de hartklep zowel ruimtelijk als tijdelijk heterogeen, waardoor het moeilijk is om conclusies te trekken over experimenten met betrekking tot ECM-organisatie als de bemonstering en exterieur niet vastliggen. Conventionele 3D-karakteriseringsmethoden, zoals MRI of 3D-echocardiografie, bieden niet de resolutie die nodig is om ECM-componenten9,10op te lossen .
Dit werk beschrijft een volledig correlatieve workflow waarbij de temporele heterogeniteit als gevolg van de hartcyclus werd aangepakt door de conformatie van de muriene PV met hydrostatische transvalvulaire druk vast te stellen. De ruimtelijke heterogeniteit werd nauwkeurig gecontroleerd door bemonsteringsgebieden van belang en het registreren van datasets van verschillende beeldvormende modaliteiten, met name μCT en seriële blok gezichtsscan elektronenmicroscopie, over verschillende lengteschalen. Deze methode van scouting met μCT voor het begeleiden van downstreambemonstering is eerder voorgesteld, maar omdat de longklep temporele variatie vertoont, was een extra niveau van controle nodig op chirurgisch niveau11.
In vivo studies die muriene hartklepbiomechanica beschrijven, zijn schaars en vertrouwen in plaats daarvan op rekenmodellen bij het beschrijven van het vervormingsgedrag. Het is van cruciaal belang dat lokale extracellulaire gegevens op de nanometerlengteschaal verband houden met de geometrie en locatie van de hartklep. Dit biedt op zijn beurt kwantificeerbare, ruimtelijk in kaart gebrachte distributies van mechanisch bijdragende ECM-eiwitten, die kunnen worden gebruikt om bestaande biomechanische hartklepmodellen12,13,14te versterken .
Protocol
Representative Results
Discussion
Verwijdering van de ventrikels dient twee doeleinden. Ten eerste, het blootstellen van de ventrikelzijde aan de atmosferische druk, waardoor alleen een transvalvulaire druk van de arteriële kant van de longklep hoeft te worden uitgeoefend om te sluiten, en ten tweede, het verstrekken van een stabiele basis om verdraaiing van de longstam te voorkomen. Tijdens drukopzetting disteneert de longstam radiaal en inferieur, waardoor deze gevoelig is voor verdraaiing, waardoor de longstam instort. Het voorladen van de longklep m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door R01HL139796 en R01HL128847 subsidies aan CKB en RO1DE028297 en CBET1608058 voor DWM.
Materials
| 25% glutaraldehyde (aq) | EMS | 16210 | Primary fixative component |
| 0.9% sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 200 proof ethanol | EMS | 15055 | |
| 22G needle | BD | 305156 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. | MX5311L | |
| 4% osmium tetroxide | EMS | 19150 | Staining component |
| 4% paraformaldehyde (aq) | EMS | 157-4-100 | Primary fixative component |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| Acetone | EMS | 10012 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical instruments Corporation | TI38402 | |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical instruments Corporation | SN-1956 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 664 | Approximately 1 yo |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| Cotton tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Dumont #7 fine forcep | FST | 11274-20 | |
| Durcupan ACM resin | EMS | 14040 | For embedding |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Heliscan microCT | Thermo Fisher Scientific | Micro-CT | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | 56-84-8 | Staining component |
| Lead nitrate | EMS | 17900 | Staining component |
| low-vacuum backscatter detector | Thermo Fisher Scientific | VSDBS | SEM backscatter detector |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile | EMD Millipore | SLGP033NS | |
| Non-woven songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | Staining component |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| Pressure monitor line | Smiths Medical ASD, Inc. | MX562 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| Size 3 BEEM capsule | EMS | 69910-01 | Embedding container |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-99-3 | Buffer |
| Solibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Sputter, carbon and e-beam coater | Leica | EM ACE600 | Gold coater |
| Surgical microscope | Leica | M80 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | EMS | 21900 | Staining component |
| Tish needle holder/forcep | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Staining component |
| Volumescope scanning electron microscope | Thermo Fisher Scientific | VOLUMESCOPESEM | Serial Block Face Scanning Electron Microscope |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 |
References
- Azari, S., et al. A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease. Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).
- Ng, C. M., et al. TGF-β-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome. Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).
- Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).
- Jiménez-Altayó, F., et al. Stenosis coexists with compromised α1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome. Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).
- Thacoor, A. Mitral valve prolapse and Marfan syndrome. Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).
- McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -. C., Hastings, K., Dawson, H. A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes. The Minipig in Biomedical Research. , (2011).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Hinton, R. B., et al. Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).
- Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. Heart valve function: a biomechanical perspective. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure. Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).
- Ayoub, S., et al. Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology. Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).
- Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet. Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).
- Korn, E. D., Weisman, R. A. I. loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Hinton, R. B., et al. Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).
- Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development. Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).
- Hamatani, Y., et al. Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation. PLoS One. 11 (8), (2016).
