Chirurgie und Probenverarbeitung zur korrelativen Bildgebung der murinen Pulmonalklappe
Summary
Hier beschreiben wir einen korrelativen Workflow für die Exzision, Druckbeaufschlagung, Fixierung und Bildgebung der murinen Pulmonalklappe, um die grobe Konformation und lokale extrazelluläre Matrixstrukturen zu bestimmen.
Abstract
Die zugrunde liegenden Ursachen der Herzklappenerkrankung (HVD) sind schwer fassbar. Murine Tiermodelle bieten ein hervorragendes Werkzeug für die Untersuchung von HVD, aber das chirurgische und instrumentelle Fachwissen, das erforderlich ist, um die Struktur und Organisation über mehrere Längenskalen hinweg genau zu quantifizieren, hat seinen Fortschritt behindert. Diese Arbeit bietet eine detaillierte Beschreibung der murinen Dissektion, der En-bloc-Färbung, der Probenverarbeitung und der korrelativen Bildgebungsverfahren zur Darstellung der Herzklappe auf verschiedenen Längenskalen. Hydrostatischer Transvalvulardruck wurde verwendet, um die zeitliche Heterogenität durch chemische Fixierung der Herzklappenkonformation zu kontrollieren. Die Mikro-Computertomographie (μCT) wurde verwendet, um die Geometrie der Herzklappe zu bestätigen und eine Referenz für die nachgelagerte Probenverarbeitung zu liefern, die für die serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-REM) erforderlich ist. Hochauflösende serielle REM-Bilder der extrazellulären Matrix (ECM) wurden aufgenommen und rekonstruiert, um eine lokale 3D-Darstellung ihrer Organisation zu erhalten. μCT- und SBF-SEM-Bildgebungsverfahren wurden dann korreliert, um die räumliche Variation über die Pulmonalklappe zu überwinden. Obwohl sich die vorgestellte Arbeit ausschließlich auf die Pulmonalklappe betrifft, könnte diese Methodik zur Beschreibung der hierarchischen Organisation in biologischen Systemen übernommen werden und ist entscheidend für die strukturelle Charakterisierung über mehrere Längenskalen hinweg.
Introduction
Die Pulmonalklappe (PV) dient dazu, eine unidirektionale Durchblutung zwischen dem rechten Ventrikel und der Lungenarterie sicherzustellen. Lungenklappenfehlbildungen sind mit verschiedenen Formen angeborener Herzerkrankungen verbunden. Die aktuelle Behandlung für angeborene Herzklappenerkrankungen (HVD) ist die Klappenreparatur oder der Klappenersatz, was mehrere invasive Operationen während des gesamten Lebens eines Patienten erfordern kann1. Es ist allgemein anerkannt, dass die Funktion der Herzklappe von ihrer Struktur abgeleitet wird, die oft als Struktur-Funktions-Korrelat bezeichnet wird. Genauer gesagt bestimmen die geometrischen und biomechanischen Eigenschaften des Herzens seine Funktion. Die mechanischen Eigenschaften wiederum werden durch die Zusammensetzung und Organisation des ECM bestimmt. Durch die Entwicklung einer Methode zur Bestimmung der biomechanischen Eigenschaften von murinen Herzklappen können transgene Tiermodelle verwendet werden, um die Rolle des ECM auf die Herzklappenfunktion und Dysfunktionabzufragen 2,3,4,5.
Das mausige Tiermodell gilt seit langem als Standard für molekulare Studien, da transgene Modelle bei Mäusen im Vergleich zu anderen Arten leichter verfügbar sind. Murine transgene Modelle bieten eine vielseitige Plattform für die Erforschung herzklappenbedingter Erkrankungen6. Das chirurgische Know-how und die Instrumentierungsanforderungen, um sowohl die Geometrie als auch die ECM-Organisation zu charakterisieren, waren jedoch eine große Hürde für den Fortschritt der HVD-Forschung. Hstologische Daten in der Literatur liefern ein Bild in den gehalt an extrazellulären Matrixen der mausinen Herzklappe, jedoch nur in Form von 2D-Bildern, und können ihre 3D-Architektur nicht beschreiben7,8. Darüber hinaus ist die Herzklappe sowohl räumlich als auch zeitlich heterogen, was es schwierig macht, über Experimente hinweg Rückschlüsse auf die ECM-Organisation zu ziehen, wenn die Probenahme und Konformation nicht festgelegt sind. Herkömmliche 3D-Charakterisierungsmethoden wie MRT oder 3D-Echokardiographie bieten nicht die Auflösung, die erforderlich ist, um ECM-Komponenten9,10aufzulösen.
Diese Arbeit beschreibt einen vollständig korrelativen Arbeitsablauf, bei dem die zeitliche Heterogenität aufgrund des Herzzyklus durch Fixierung der Konformation der murinen PV mit hydrostatischem Transvalvulardruck angesprochen wurde. Die räumliche Heterogenität wurde präzise kontrolliert, indem Bereiche von Interesse abgesonden und Datensätze aus verschiedenen Bildgebungsmodalitäten, insbesondere μCT und serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie, über verschiedene Längenskalen registriert wurden. Diese Methode des Scoutings mit μCT zur Führung der nachgelagerten Probenahme wurde bereits vorgeschlagen, aber da die Pulmonalklappe zeitliche Variationen aufweist, war eine zusätzliche Kontrollebene auf der chirurgischen Ebene11erforderlich.
In-vivo-Studien, die die Biomechanik der murinen Herzklappe beschreiben, sind spärlich und stützen sich stattdessen bei der Beschreibung des Deformationsverhaltens auf Computermodelle. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass lokale extrazelluläre Daten auf der Nanometerlängenskala mit der Geometrie und Lage der Herzklappe in Verbindung stehen. Dies wiederum liefert quantifizierbare, räumlich abgebildete Verteilungen von mechanisch beitragenden ECM-Proteinen, mit denen bestehende biomechanische Herzklappenmodelle verstärkt werden können12,13,14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Entfernung der Ventrikel dient zwei Zwecken. Erstens, die Ventrikelseite dem atmosphärischen Druck auszusetzen, wodurch nur ein transvalvulärer Druck von der arteriellen Seite der Pulmonalklappe ausgeübt werden muss, um sich zu schließen, und zweitens, eine stabile Basis bereitzustellen, um eine Verdrehung des Lungenstamms zu verhindern. Während der Druckbeaufschlägeung dehnung sich der Lungenstamm radial und minderwertig, wodurch er anfällig für Verdrehungen wird, was zum Zusammenbruch des Lungenstamms führ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird teilweise durch R01HL139796- und R01HL128847-Zuschüsse an CKB und RO1DE028297 und CBET1608058 für DWM unterstützt.
Materials
| 25% glutaraldehyde (aq) | EMS | 16210 | Primary fixative component |
| 0.9% sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 200 proof ethanol | EMS | 15055 | |
| 22G needle | BD | 305156 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. | MX5311L | |
| 4% osmium tetroxide | EMS | 19150 | Staining component |
| 4% paraformaldehyde (aq) | EMS | 157-4-100 | Primary fixative component |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| Acetone | EMS | 10012 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical instruments Corporation | TI38402 | |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical instruments Corporation | SN-1956 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 664 | Approximately 1 yo |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| Cotton tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Dumont #7 fine forcep | FST | 11274-20 | |
| Durcupan ACM resin | EMS | 14040 | For embedding |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Heliscan microCT | Thermo Fisher Scientific | Micro-CT | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | 56-84-8 | Staining component |
| Lead nitrate | EMS | 17900 | Staining component |
| low-vacuum backscatter detector | Thermo Fisher Scientific | VSDBS | SEM backscatter detector |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile | EMD Millipore | SLGP033NS | |
| Non-woven songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | Staining component |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| Pressure monitor line | Smiths Medical ASD, Inc. | MX562 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| Size 3 BEEM capsule | EMS | 69910-01 | Embedding container |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-99-3 | Buffer |
| Solibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Sputter, carbon and e-beam coater | Leica | EM ACE600 | Gold coater |
| Surgical microscope | Leica | M80 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | EMS | 21900 | Staining component |
| Tish needle holder/forcep | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Staining component |
| Volumescope scanning electron microscope | Thermo Fisher Scientific | VOLUMESCOPESEM | Serial Block Face Scanning Electron Microscope |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 |
References
- Azari, S., et al. A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease. Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).
- Ng, C. M., et al. TGF-β-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome. Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).
- Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).
- Jiménez-Altayó, F., et al. Stenosis coexists with compromised α1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome. Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).
- Thacoor, A. Mitral valve prolapse and Marfan syndrome. Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).
- McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -. C., Hastings, K., Dawson, H. A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes. The Minipig in Biomedical Research. , (2011).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Hinton, R. B., et al. Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).
- Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. Heart valve function: a biomechanical perspective. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure. Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).
- Ayoub, S., et al. Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology. Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).
- Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet. Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).
- Korn, E. D., Weisman, R. A. I. loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Hinton, R. B., et al. Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).
- Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development. Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).
- Hamatani, Y., et al. Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation. PLoS One. 11 (8), (2016).
