ניתוח ועיבוד מדגם להדמיה קורלטיבית של שסתום הריאות מורין
Summary
כאן, אנו מתארים זרימת עבודה מתאם עבור כריתה, לחץ, קיבעון, והדמיה של שסתום הריאות מורין כדי לקבוע את הקונפורמציה ברוטו ומבני מטריצה חוץ תאיים מקומיים.
Abstract
הגורמים הבסיסיים למחלות הקשורות לשסתום הלב (HVD) הם חמקמקים. מודלים של בעלי חיים מורינים מספקים כלי מצוין לחקר HVD, עם זאת, המומחיות הכירורגית והאינסמנטלית הנדרשת לכימות מדויק של המבנה והארגון על פני קשקשים באורך רב עיכבו את התקדמותו. עבודה זו מספקת תיאור מפורט של ניתוח מורין, כתמי גוש, עיבוד מדגם, והליכי הדמיה מתאם לתיאור שסתום הלב בקשקשים באורך שונה. לחץ טרנס-וואולי הידרוסטטי שימש לשליטה בהטרוגניות הטמפורלית על ידי תיקון כימי של קונפורמציה שסתום הלב. טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (μCT) שימשה לאישור הגיאומטריה של שסתום הלב ולספק התייחסות לעיבוד מדגם במורד הזרם הדרוש למיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת פנים של בלוק טורי (SBF-SEM). תמונות SEM טוריות ברזולוציה גבוהה של המטריצה החוץ-תאית (ECM) צולמו ושוחזרו כדי לספק ייצוג תלת-ממדי מקומי של הארגון שלה. שיטות הדמיה μCT ו- SBF-SEM היו אז בקורלציה כדי להתגבר על השונות המרחבית על פני שסתום הריאות. למרות העבודה המוצגת היא אך ורק על שסתום הריאות, מתודולוגיה זו יכולה להיות מאומצת לתיאור הארגון ההיררכי במערכות ביולוגיות והיא מרכזית עבור האפיון המבני על פני קשקשים באורך מרובה.
Introduction
שסתום הריאות (PV) משמש כדי להבטיח זרימת דם חד כיוונית בין החדר הימני לעורק הריאות. מומים שסתום ריאות קשורים עם מספר צורות של מחלת לב מולדת. הטיפול הנוכחי למחלת שסתום לב מולדת (HVD) הוא תיקון valvular או החלפת שסתום, אשר יכול לדרוש ניתוחים פולשניים מרובים לאורך חייו של המטופל1. זה כבר מקובל כי הפונקציה של שסתום הלב נגזר מהמבנה שלה, המכונה לעתים קרובות את המבנה-פונקציה בקורלציה. ליתר דיוק, המאפיינים הגיאומטריים והביומכניים של הלב מכתיבים את תפקידו. המאפיינים המכניים, בתורם, נקבעים על ידי הרכב וארגון של ECM. על ידי פיתוח שיטה לקביעת המאפיינים הביומכניים של שסתומי לב מורינה, מודלים בעלי חיים מהונדסים יכולים לשמש כדי לחקור את התפקיד של ECM על תפקוד שסתום הלב תפקוד לקוי2,3,4,5.
מודל בעלי החיים המוריני נחשב זה מכבר לסטנדרט למחקרים מולקולריים מכיוון שמודלים מהונדסים זמינים יותר בעכברים בהשוואה למינים אחרים. מודלים מהונדסים מורין לספק פלטפורמה רב-תכליתית לחקר מחלות הקשורות שסתום לב6. עם זאת, המומחיות הכירורגית ודרישות המכשור לאפיון הן הגיאומטריה והן ארגון ECM היוו משוכה משמעותית בהתקדמות מחקר HVD. נתונים Hstological בספרות מספק תמונה לתוך תוכן מטריצה חוץ תאית שסתום לב מורין, אבל רק בצורה של תמונות 2D, ואינם מסוגלים לתאר את הארכיטקטורה 3D שלה7,8. בנוסף, שסתום הלב הוא הן מרחבי והן זמני הטרוגניים, מה שמקשה להסיק מסקנות על פני ניסויים לגבי ארגון ECM אם הדגימה וההתאמה אינם קבועים. שיטות אפיון תלת-ממדיות קונבנציונליות, כגון MRI או אקו-קרדיוגרפיה תלת-ממדית, אינן מספקות את הפתרון הדרוש לפתרון רכיבי ECM9,10.
עבודה זו מפרטת זרימת עבודה מתאם לחלוטין שבו הטרוגניות הטמפורלית עקב מחזור הלב טופלה על ידי תיקון הקונפורמציה של PV מורין עם לחץ טרנסוולבולרי הידרוסטטי. ההטרוגניות המרחבית נשלטה דווקא על ידי דגימת אזורי עניין ורישום ערכות נתונים מאופני הדמיה שונים, במיוחד μCT ומיקרוסקופיית פנים בלוק סדרתית סורקת מיקרוסקופיית אלקטרונים, על פני סולמות אורך שונים. שיטה זו של סקאוטינג עם μCT להנחיית דגימה במורד הזרם הוצעה בעבר, אך מכיוון ששסתום הריאות מציג וריאציה זמנית, היה צורך ברמת שליטה נוספת ברמה הניתוחית11.
במחקרים המתארים ביומכניקה של שסתום לב מוריני הם דלילים, ובמקום זאת, מסתמכים על מודלים חישוביים כאשר הם מתארים את התנהגות העיוות. זה בעל חשיבות קריטית כי נתונים חוץ תאיים מקומיים על סולם אורך ננומטר להיות קשורים הגיאומטריה ואת המיקום של שסתום הלב. זה, בתורו, מספק לכימות, מופה מרחבי הפצות של חלבוני ECM תורמים מכנית, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לחזק את המודלים הקיימים שסתום הלב הביומכני12,13,14.
Protocol
Representative Results
Discussion
הסרת החדרים משרתת שתי מטרות. ראשית, חשיפת צד החדר ללחץ האטמוספרי, ובכך רק צריך להפעיל לחץ transvalvular מהצד העורקי של שסתום הריאות כדי לסגור, ושנית, מתן בסיס יציב כדי למנוע פיתול של גזע הריאות. במהלך לחץ, תא המטען הריאתי נפסק באופן רדיאלי ונחות, מה שהופך אותו נוטה פיתול, גרימת קריסה של תא המטען הרי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת, בין השאר, על ידי R01HL139796 ומענקי R01HL128847 ל- CKB ו- RO1DE028297 ו- CBET1608058 עבור DWM.
Materials
| 25% glutaraldehyde (aq) | EMS | 16210 | Primary fixative component |
| 0.9% sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 200 proof ethanol | EMS | 15055 | |
| 22G needle | BD | 305156 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. | MX5311L | |
| 4% osmium tetroxide | EMS | 19150 | Staining component |
| 4% paraformaldehyde (aq) | EMS | 157-4-100 | Primary fixative component |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| Acetone | EMS | 10012 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical instruments Corporation | TI38402 | |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical instruments Corporation | SN-1956 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 664 | Approximately 1 yo |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| Cotton tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Dumont #7 fine forcep | FST | 11274-20 | |
| Durcupan ACM resin | EMS | 14040 | For embedding |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Heliscan microCT | Thermo Fisher Scientific | Micro-CT | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | 56-84-8 | Staining component |
| Lead nitrate | EMS | 17900 | Staining component |
| low-vacuum backscatter detector | Thermo Fisher Scientific | VSDBS | SEM backscatter detector |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile | EMD Millipore | SLGP033NS | |
| Non-woven songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | Staining component |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| Pressure monitor line | Smiths Medical ASD, Inc. | MX562 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| Size 3 BEEM capsule | EMS | 69910-01 | Embedding container |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-99-3 | Buffer |
| Solibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Sputter, carbon and e-beam coater | Leica | EM ACE600 | Gold coater |
| Surgical microscope | Leica | M80 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | EMS | 21900 | Staining component |
| Tish needle holder/forcep | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Staining component |
| Volumescope scanning electron microscope | Thermo Fisher Scientific | VOLUMESCOPESEM | Serial Block Face Scanning Electron Microscope |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 |
References
- Azari, S., et al. A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease. Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).
- Ng, C. M., et al. TGF-β-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome. Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).
- Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).
- Jiménez-Altayó, F., et al. Stenosis coexists with compromised α1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome. Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).
- Thacoor, A. Mitral valve prolapse and Marfan syndrome. Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).
- McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -. C., Hastings, K., Dawson, H. A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes. The Minipig in Biomedical Research. , (2011).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Hinton, R. B., et al. Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).
- Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. Heart valve function: a biomechanical perspective. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure. Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).
- Ayoub, S., et al. Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology. Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).
- Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet. Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).
- Korn, E. D., Weisman, R. A. I. loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Hinton, R. B., et al. Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).
- Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development. Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).
- Hamatani, Y., et al. Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation. PLoS One. 11 (8), (2016).
