Cirurgia e Processamento de Amostras para Imagem Correlativa da Válvula Pulmonar Murina
Summary
Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho correlativo para a excisão, pressurização, fixação e imagem da válvula pulmonar murina para determinar a conformação bruta e as estruturas da matriz extracelular local.
Abstract
As causas subjacentes da doença relacionada à válvula cardíaca (HVD) são evasivas. Os modelos animais murinos fornecem uma excelente ferramenta para estudar HVD, no entanto, a perícia cirúrgica e instrumental necessária para quantificar com precisão a estrutura e a organização em múltiplas escalas de comprimento têm prejudicado seu avanço. Este trabalho fornece uma descrição detalhada da dissecção de murina, coloração em bloco, processamento de amostras e procedimentos de imagem correlativo para a representação da válvula cardíaca em diferentes escalas de comprimento. A pressão transvalvular hidrostática foi usada para controlar a heterogeneidade temporal fixando quimicamente a conformação da válvula cardíaca. A tomografia microcomputada (μCT) foi usada para confirmar a geometria da válvula cardíaca e fornecer uma referência para o processamento da amostra a jusante necessária para a microscopia eletrônica de varredura facial do bloco serial (SBF-SEM). Imagens sem em série de alta resolução da matriz extracelular (ECM) foram tiradas e reconstruídas para fornecer uma representação 3D local de sua organização. Os métodos de imagem μCT e SBF-SEM foram então correlacionados para superar a variação espacial através da válvula pulmonar. Embora o trabalho apresentado seja exclusivamente sobre a válvula pulmonar, essa metodologia poderia ser adotada para descrever a organização hierárquica em sistemas biológicos e é fundamental para a caracterização estrutural em múltiplas escalas de comprimento.
Introduction
A válvula pulmonar (PV) serve para garantir o fluxo sanguíneo unidirecional entre o ventrículo direito e a artéria pulmonar. Malformações da válvula pulmonar estão associadas a várias formas de doença cardíaca congênita. O tratamento atual para doença da válvula cardíaca congênita (HVD) é o reparo valvular ou substituição da válvula, que pode exigir múltiplas cirurgias invasivas ao longo da vida1do paciente . Tem sido amplamente aceito que a função da válvula cardíaca é derivada de sua estrutura, muitas vezes referida como a correlação estrutura-função. Mais especificamente, as propriedades geométricas e biomecânicas do coração ditam sua função. As propriedades mecânicas, por sua vez, são determinadas pela composição e organização do ECM. Ao desenvolver um método para determinar as propriedades biomecânicas das válvulas cardíacas murinas, modelos animais transgênicos podem ser usados para interrogar o papel do ECM na função da válvula cardíaca e disfunção2,3,4,5.
O modelo animal murino tem sido considerado como o padrão para estudos moleculares porque modelos transgênicos estão mais facilmente disponíveis em camundongos em comparação com outras espécies. Os modelos transgênicos de Murine fornecem uma plataforma versátil para pesquisar doenças relacionadas à válvula cardíaca6. No entanto, os requisitos de perícia cirúrgica e instrumentação para caracterizar tanto a geometria quanto a organização do ECM têm sido um grande obstáculo no progresso da pesquisa de HVD. Os dados hstológicos na literatura fornecem uma imagem no conteúdo de matriz extracelular da válvula cardíaca murina, mas apenas na forma de imagens 2D, e são incapazes de descrever sua arquitetura 3D7,8. Além disso, a válvula cardíaca é espacial e temporalmente heterogênea, dificultando a tiração de conclusões entre experimentos relativos à organização do ECM se a amostragem e a conformação não forem corrigidas. Métodos convencionais de caracterização 3D, como ressonância magnética ou ecocardiografia 3D, não fornecem a resolução necessária para resolver os componentes ECM9,10.
Este trabalho detalha um fluxo de trabalho totalmente correlativo onde a heterogeneidade temporal devido ao ciclo cardíaco foi abordada pela fixação da conformação do Pv murina com pressão transvalvular hidrostática. A heterogeneidade espacial foi controlada precisamente por regiões de amostragem de interesse e registro de conjuntos de dados de diferentes modalidades de imagem, especificamente μCT e microscopia eletrônica de varredura facial de blocos seriais, em diferentes escalas de comprimento. Este método de exploração com μCT para orientação da amostragem a jusante foi proposto anteriormente, mas como a válvula pulmonar apresenta variação temporal, foi necessário um nível adicional de controle no nível cirúrgico11.
Estudos in vivo descrevendo a biomecânica da válvula cardíaca murina são esparsas e, em vez disso, dependem de modelos computacionais ao descrever o comportamento de deformação. É de fundamental importância que os dados extracelulares locais sobre a escala de comprimento do nanômetro estejam relacionados com a geometria e localização da válvula cardíaca. Isso, por sua vez, fornece distribuições quantificáveis e espacialmente mapeadas de proteínas ECM que contribuem mecanicamente, que podem ser utilizadas para reforçar os modelos de válvula cardíaca biomecânica existentes12,13,14.
Protocol
Representative Results
Discussion
A remoção dos ventrículos serve a dois propósitos. Primeiro, expondo o lado ventrículo à pressão atmosférica, precisando, assim, apenas aplicar uma pressão transvalvular do lado arterial da válvula pulmonar para fechar, e segundo, fornecendo uma base estável para evitar a torção do tronco pulmonar. Durante a pressurização, o tronco pulmonar distendida radialmente e inferiormente, tornando-o propenso a torção, causando o colapso do tronco pulmonar. A pré-carga da válvula pulmonar com uma solução salin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado, em parte, pelas subvenções R01HL139796 e R01HL128847 para as bolsas CKB e RO1DE028297 e CBET1608058 para DWM.
Materials
| 25% glutaraldehyde (aq) | EMS | 16210 | Primary fixative component |
| 0.9% sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 200 proof ethanol | EMS | 15055 | |
| 22G needle | BD | 305156 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. | MX5311L | |
| 4% osmium tetroxide | EMS | 19150 | Staining component |
| 4% paraformaldehyde (aq) | EMS | 157-4-100 | Primary fixative component |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| Acetone | EMS | 10012 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical instruments Corporation | TI38402 | |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical instruments Corporation | SN-1956 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 664 | Approximately 1 yo |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| Cotton tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Dumont #7 fine forcep | FST | 11274-20 | |
| Durcupan ACM resin | EMS | 14040 | For embedding |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Heliscan microCT | Thermo Fisher Scientific | Micro-CT | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | 56-84-8 | Staining component |
| Lead nitrate | EMS | 17900 | Staining component |
| low-vacuum backscatter detector | Thermo Fisher Scientific | VSDBS | SEM backscatter detector |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile | EMD Millipore | SLGP033NS | |
| Non-woven songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | Staining component |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| Pressure monitor line | Smiths Medical ASD, Inc. | MX562 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| Size 3 BEEM capsule | EMS | 69910-01 | Embedding container |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-99-3 | Buffer |
| Solibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Sputter, carbon and e-beam coater | Leica | EM ACE600 | Gold coater |
| Surgical microscope | Leica | M80 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | EMS | 21900 | Staining component |
| Tish needle holder/forcep | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Staining component |
| Volumescope scanning electron microscope | Thermo Fisher Scientific | VOLUMESCOPESEM | Serial Block Face Scanning Electron Microscope |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 |
References
- Azari, S., et al. A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease. Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).
- Ng, C. M., et al. TGF-β-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome. Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).
- Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).
- Jiménez-Altayó, F., et al. Stenosis coexists with compromised α1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome. Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).
- Thacoor, A. Mitral valve prolapse and Marfan syndrome. Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).
- McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -. C., Hastings, K., Dawson, H. A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes. The Minipig in Biomedical Research. , (2011).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Hinton, R. B., et al. Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).
- Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. Heart valve function: a biomechanical perspective. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure. Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).
- Ayoub, S., et al. Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology. Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).
- Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet. Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).
- Korn, E. D., Weisman, R. A. I. loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Hinton, R. B., et al. Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).
- Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development. Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).
- Hamatani, Y., et al. Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation. PLoS One. 11 (8), (2016).
