Summary
该协议提供了从DNA提取到数字液滴PCR（ddPCR）实验设置的步骤，包括分析gRNA诱导的Cas9切割和DNA修复后靶位点的非同源末端连接（NHEJ）事件。该方法的其他用途包括多态性检测和基因编辑变异验证等应用。
Abstract
蚊子基因组学和基因工程技术的最新进展促使人们需要快速有效的方法来大规模检测靶向DNA序列变异。具体而言，检测由CRISPR引导RNA（gRNA）/Cas9介导的非同源末端连接（NHEJ）产生的基因编辑位点的插入和缺失（indels）对于评估诱变的保真度和意外变化的频率非常重要。我们在这里描述了一种数字液滴PCR（ddPCR）方案，该协议非常适合高通量NHEJ分析。虽然这种方法不会产生识别单个序列变异的数据，但它提供了总体内序列变异的定量估计。此外，通过适当的资源，该方案可以比下一代或Sanger测序更容易在现场实验室环境中实施。ddPCR的结果周转时间也比这两种方法都快，这使得在基因工程生物的田间试验期间可以更快速，更完整地分析野生种群的遗传变异。
Introduction
基因驱动具有巨大的潜力来控制具有医学和农业相关性的昆虫种群1，2，3，4，5。例如，基于CRISPR Cas核酸酶和向导RNA（gRNA）的基因驱动系统可用于通过引入赋予疟疾寄生虫难治性的特征来改变载体蚊子种群，从而减少传播并减少疾病1，4，5。基因驱动系统将自身和相关性状从减数分裂前生殖细胞中的一条同源染色体复制到另一条染色体，这确保了大多数后代继承了驱动力，并创造了在该领域持久和可持续地改变种群的潜力。然而，基于Cas / gRNA的方法的一个缺点是通过非同源末端连接（NHEJ）DNA修复产生插入和缺失（indel）突变的可能性，从而导致驱动抗性等位基因的产生，当在群体中积累到足够高的频率时，可以阻止驱动系统扩散1，2，3，4.该协议详细介绍了一种高通量和可靠的方法，该方法可以在基于Cas / gRNA的基因驱动期间确定群体和个体水平上indel突变的患病率和相对数量。
下一代测序（NGS）方法提供无与伦比的测序分辨率。然而，与NGS相关的成本和技术要求禁止常规测试，并限制其用作评估indels6，7，8的高通量方法。传统的PCR定量方法长期以来一直被用作基因组内嵌的标准评估程序;然而，这些方法是劳动密集型的，需要很长时间才能获得数据，并且具有高度的可变性。在某些应用中，数字液滴PCR（ddPCR）已被证明在检测突变方面比Sanger测序更敏感，并且在其他应用中的检测限低于NGS 6，7，8，9。此外，对于ddPCR，评估样品集的成本和获得结果的周转时间分别比Sanger测序或NGS9更便宜，更快。使用双探针系统，滴定测定基于gRNA靶标Cas9切割位点不存在野生型（WT）序列来鉴定NHEJ等位基因。在该测定中，用特定的引物对扩增包含Cas / gRNA系统预测切割位点的短扩增子。一个荧光探针被设计为与扩增子的保守区域结合，另一个荧光探针识别切割位点的WT序列。在NHEJ等位基因存在下，后者不会与扩增子结合。
使用ddPCR提供了设计引物以靶向缺失，单碱基对差异和插入的能力，这将允许在蚊子种群分析中进行NHEJ分析9。鉴于这些有吸引力的功能，我们创建了一个ddPCR方案，用于高通量检测蚊子中基于Cas / gRNA的基因驱动系统产生的indels。
Protocol
1. 基因提取
- 制备EDTA/核裂解缓冲液（EDTA/NLS），每个样品的比例为500μLNLS和120μLEDTA。放大多个样品。将混合物在冰上冷却。
注意：冷却后，溶液将在2-5分钟内变云，具体取决于体积。 - 使用机械均质器在装有600μL冷冻EDTA / NLS的1.5 mL微量离心管中均质灭蚊样品10-15秒;彻底混合。
- 将17.5μL20mg / mL蛋白酶K加入试管中并充分混合。
- 在55°C下孵育过夜。 或者，将样品在55°C下孵育3小时，摇动并每1小时涡旋样品。
- 向室温样品中加入200μL蛋白质沉淀溶液，并剧烈涡旋20 s。
- 将样品在冰上冷却5分钟。
- 将样品离心至15，890 RCF沉淀蛋白质4分钟。
- 小心地吸出含有DNA的上清液，并将其转移到含有600μL异丙醇的清洁的1.5mL微量离心管中。
- 通过倒置管5-10次轻轻混合溶液。在15，890 RCF下离心1分钟。小心地倾析上清液，同时保留DNA沉淀。
- 加入600μL室温70%乙醇。通过轻轻倒置管来洗涤造粒的DNA。
- 在15，890 RCF下离心1分钟。使用玻璃移液器吸头小心地除去上清液。
- 将管倒置到干净的吸水纸上，并将沉淀风干10-15分钟。
- 用PCR级水重悬DNA。每个蚊子样品使用20μL，或100μL用于10个混合蚊子。
注：使用市售试剂盒（见 材料表）的蚊子样品的DNA提取方法改编自制造商的从组织培养细胞和动物组织中分离基因组DNA方案。
2. ddPCR反应及液滴生成制备
- 使用荧光计定量DNA。
注意：对于滴定测定，建议每次反应使用3，000-30，000单倍体基因组拷贝的范围，其设计用于使用HEX标记探针检测NHEJ事件，该探针与靶切位点的WT序列结合，并且在靶位点存在缺失或插入时不会退火（滴落）， 表示存在 NHEJ 变体。 - 使用单倍体基因组重量和提取物中DNA的浓度计算拷贝数。这是通过将提取的DNA的浓度乘以用于获得总DNA质量的体积，然后将其除以单倍体基因组重量来完成的。确保添加的体积在1-10μL之间，根据需要稀释以达到推荐的单倍体基因组拷贝范围。
注意：一 个冈比亚按蚊 单倍体基因组估计为每只成年蚊子10 0.27pg 。 - 设计引物和探针。设计引物熔化温度（Tm）在55-60°C范围内的前向和反向寡核苷酸引物，其位于gRNA靶位点的5'和3'末端，产生150-400 bp的扩增子。
- 用于NHEJ检测的HEX（六氯荧光素）标记探针：设计一个长度约为15-20 bp的寡核苷酸，与靶位点互补，并将HEX探针添加到5'端，将BHQ1（BLack Hole Quencher 1）添加到3'端。水解探针的Tm应比引物的Tm高3-10°C。
- FAM（6-羧基荧光素）标记的探针供参考WT：设计长度约为15-20 bp的寡核苷酸，与远离靶位点（约25 bp）的保守基因组位点互补，并将FAM探针添加到5'末端，BHQ1添加到3'末端。水解探针的Tm应比引物的Tm高3-10°C。
3. PCR反应制备
- 用以下组分制备25μLdPCR样品混合物：用于探针的ddPCR超级混合物（无UTP）：12.5μL，正向和反向引物（10μM）：每个1μL，HEX / FAM探针（10μM）：每个0.625μL，DNA：1-5μL（3，750-37，500单倍体基因组拷贝）和水：高达25μL。
- 通过涡流或回流移液（上下）（20x）彻底混合反应。
注意：如果反应在96孔板中，请上下移取整个体积20次，而不是涡旋以避免气泡形成。 - 短暂离心样品以将混合物沉降在管底部或孔中。
注意：确保反应在室温下产生液滴。为每个墨盒中的额外/未使用的孔准备1x的ddPCR混合物（每个墨盒有8个孔）。
4. 液滴生成
- 使用50μL多通道移液器，将20μL的ddPCR样品混合物加载到墨盒的中间行（图1A，顶部）。
- 将70μL油装入底排。将20 μL的1x ddPCR超混液加载到未使用的孔中。
注意：不要引入气泡。 - 将垫片仅接触边缘，避免中心凹陷区域（图1B）。
- 将板牢固地放入液滴发生器中，然后合上盖子以开始运行。
- 使用多通道移液器，将40μL的表液混合物从墨盒的顶排（图1A，底部）转移到96孔板中。
- 以45-30°的角度绘制液体样品3-5秒。将混合物以45°角缓慢排出超过3秒到井的侧面，使其从侧面滴落。可以去移液器的第二站（完全排出）以排出所有液体。
- 使用箔热封，在180°C下密封板5秒。
5. 聚合酶链反应
- 将密封的板放入热循环器（图1C）中，并设置推荐的PCR条件，如果遵循NHEJ滴定指南如下：
- 在95°C下初始变性10分钟。
- 设置40个循环，在94°C下30秒变性，55°C1分钟退火，60°C2分钟延伸。
- 在98°C下保持10分钟。
- 保持在4°C。
注：特定引物和探针组的退火温度可以使用热梯度进行优化。所有步骤均使用 2 °C/s 的斜坡速率。应根据每个实验设计和设置调整PCR条件。
6. 液滴读数
- 将板牢固地放在液滴读取器中，在左上角有孔A-1（平滑的角，其他三个边缘）（图1D）。
- 在程序中设置板：将FAM指定为已知的参考通道，将HEX指定为未知通道（图2A）。
- 以直接定量方式运行液滴读取实验。运行完成后，将分析的"实验类型"更改为"丢弃（DOF）"（图2A）。
第7章 分析
- 指定正确的实验参数（图2A）：样品信息，SuperMix，目标名称（WT或NHEJ），目标类型（参考或未知），信号Ch1（HEX或FAM），信号Ch2（HEX或FAM），并手动设置液滴计数阈值（建议高于10，000以获得可靠的结果）。该软件将使用指定的参数执行大部分分析。
- 检查"液滴"选项卡中的液滴计数;确保所有值都高于 10，000（图 2B）。
- 检查 1 D 幅度，确保从负极中有效分离信号。
- 在"板编辑器"中，突出显示整个板并将"实验类型"设置为"丢弃"。
- 将WT目标设置为 参考，为FAM指定通道1，为HEX指定通道2。
- 将 NHEJ 目标设置为未知，将通道 1 指定为 FAM，将通道 2 指定为无。
- 在"2D 振幅"选项卡中，使用图形工具为每个样本设置聚类阈值。考虑与WT集群相关的尾部;这对于NHEJ测定是正常的（图3A）。
注意：在"比率"选项卡下，单击图表右上角的齿轮图标。选择分数丰度。该图现在将绘制一个与NHEJ事件百分比相对应的点（图3B）。
Representative Results
该程序的应用出现在Carballar-Lejarazú等人9中。ddPCR滴定测定利用两个荧光探针来识别WT和indel序列：FAM探针与扩增子内的保守序列结合，而HEX探针靶向靶向位点的WT序列（图4A）。在存在 indel 的情况下，HEX 探测器将不会绑定。代表性结果可以在Carballar-Lejarazú等人的图2，表1和表2中找到。使用该协议，ddPCR已被证明可以检测各种CRISPR-Cas9诱导的NHEJ事件，并量化单个或合并样品中的NHEJ频率。10只蚊子的15个不同混合样本，每个样本含有不同的NHEJ等位基因（Carballar-Lejarazú等人的表2。这些使用ddPCR使用此处显示的协议和参数进行分析。表19的结果表明，所有15个样品都携带通过滴剂测定法鉴定的100%indel等位基因（图4B）。在另一项实验中，用该ddPCR方案检查了11个具有不同NHEJ百分比（0%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%和100%）的WT蚊子和NHEJ蚊子的合并样本，结果（图2;Carballar-Lejarazú等人9）表明，所鉴定的百分比接近于通过扩增子分析进行Indel检测的比较技术（图4C）。
图1：实验设置和程序。 （A） 用于产生液滴的墨盒准备。（顶部）样品在滤芯的中间行填充，而油在底排填充。（底部）在液滴生成后，顶排填充乳化液滴。（B） 液滴发生器，带有装满样品的墨盒，并用垫圈覆盖到位。（C） 96 孔板，在热循环仪上覆盖有铝箔密封。（D） 液滴读取器，96 孔板就位，金属盖锁定在板上以固定。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：液滴读数。（A） 用于液滴读取的软件接口。橙色框显示带有样品的孔。灰色的盒子是空井。实验参数在"编辑工具"面板（右侧）中设置。每个样品都可以通过单击相应的样品框进行编辑。为实验类型 选择"丢弃（DOF）"。 在示例信息中，填写示例的"名称"和"类型"以及"SuperMix"的相应信息。选择"测定信息"的基本滴度。对于 WT 样本，请为"目标名称"选择"WT"，为"目标类型"选择"Ref"，为"信号 Ch1"和"Ch2"选择"FAM"和"十六进制"。对于 NHEJ 示例，请为"目标名称"填写适当的名称，为"目标类型"选择"未知"，并为"信号 Ch1"选择"FAM"。将信号 Ch2保留为"无"。（B） 多个样品的液滴计数结果。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：滴剂分析。 （A） WT 和 NHEJ 等位基因液滴计数的聚类 2D 图。在"2D 振幅"选项卡中，默认情况下，所有液滴都是未分类的。在此图中，手动指定颜色以进行区分。橙色点簇是分别通过FAM和HEX探针在参考序列和靶位点序列上结合而获得的WT等位基因计数。蓝点表示数十个液滴，这些液滴具有FAM与参考序列的结合，但在目标位点序列上没有十六进制结合（因此十六进制的丢弃）。灰色点是空液滴，没有 FAM 或十六进制绑定。（B） NHEJ事件的比率/丰度图。在 比率 选项卡下，选择 分数丰度 ，以获得具有 NHEJ 事件的相应百分比的图形。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：滴剂PCR滴定测定在转基因 按蚊 品系中用于非同源末端连接鉴定和定量的应用，AsMCRkh1。 （A） 使用双探针系统检测靶向DNA位点突变的ddPCR滴降测定的示意图。用正向和反向引物扩增150-400 bp的扩增子。FAM标记的探针被设计为与扩增子的保守序列结合，而HEX标记的探针被设计为与WT gRNA靶位点结合。（B） 用 ddPCR 检测各种类型的凹陷。使用ddPCR滴定测定法分析了10个10个AsMCRkh1蚊子池，每个池中含有各种类型的indel，包括插入，删除和替换。突变和序列的详细信息可以在Carballar 等人的表2和表S3中找到。9. （C） 使用 ddPCR 和 Amplicon Analysis 9 的 Indel 检测比较技术，以各种比例（10：0、9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9 和 0：10）定量 AsMCRkh1 和 WT 蚊子混合样品中的NHEJ。图片改编自Carballar-Lejarazú 等人生物技术。68（4）：172-179 （2020）9. 请点击此处查看此图的放大版本。
| 底漆/探针 | 序列 （5' » 3'） |
| ddPCR 正向底漆 | ATGATCAAATGTCGACCG |
| ddPCR反向引物 | ACCGTACTGGTTGAACA |
| ddPCR 十六进制探头 （BHQ1） | [十六进制]-TTCTACGGGCAGGGC-[BHQ1] |
| ddPCR FAM Probe （BHQ1） | [6FAM]-CCACGTGGGATCGAAGG-[BHQ1] |
| HEX：六氯荧光素，FAM：6-羧基荧光素，BHQ：黑洞淬灭剂 | |
表1：引物和探针的序列。
Discussion
数字液滴PCR是一种有效的方法，用于确定基于Cas / gRNA的基因驱动系统中NHEJ事件产生的indel等位基因的存在，并允许量化这些等位基因在个体或群体中的频率。需要特别注意遵循协议的某些步骤，以获得可靠的结果。首先，基因组DNA提取需要仔细进行，以确保高质量和足够的数量。良好的提取将允许准确测定每个反应的单倍体基因组拷贝。根据我们的经验，市售试剂盒（见 材料表）提供了始终如一的高质量DNA提取。然而，单个蚊子的提取可能被证明是特别具有挑战性的，因为DNA沉淀变得难以可视化，如果不小心，很容易被上清液吸走。其次，引物和探针必须仔细设计。在完成ddPCR实验之前，首先执行传统PCR并通过凝胶电泳可视化单个产物，确保设计的引物产生单个PCR产物。参考FAM探头的设计也必须使其与高度保守的序列相辅相成。这将确保在整个不同人群中准确检测WT等位基因。每个独特实验的引物/探针组合将具有不同的热循环器条件，建议使用热梯度优化这些条件。
存在其他用于鉴定indels的方法，例如Sanger测序或NGS。Sanger测序是有限的，因为它具有较低的检测限和较低的发现能力来识别新的变体。Sanger测序也是劳动密集型的，并且不是高通量。与 Sanger 测序相比，NGS 在低灵敏度、发现能力和通量方面没有相同的局限性。NGS的另一个好处是它能够检测从单核苷酸多态性（SNP）到重排的各种突变。然而，在确定Cas9 / gRNA相关内嵌的应用中，NGS是一种更昂贵且耗时的方法，因为只有一个感兴趣的靶区，并且最适合于更大的全基因组分析。与上述方法相比，ddPCR具有高吞吐量和快速周转时间。如果ddPCR材料和仪器在内部可用，则可以在1-2天内处理96个样品，非常适合快速分析Cas9 / gRNA改性生物的大型试验。
虽然 ddPCR 存在许多好处，但也存在局限性。首先，ddPCR设备在独立的实验室环境中并不常见。ddPCR设备可以在较大的研究机构中共同使用，但这并不能使机构以外的数据生成和分析变得容易。其次，与替代方案不同，ddPCR不提供已鉴定的indel突变的单个独特序列。数字液滴PCR将提供群体内凹陷突变的频率，但是如果没有该序列，就无法确定存在的凹槽是否更有可能保存或抑制目标基因的功能。ddPCR方法可能最适合在基于Cas9 / gRNA的驱动生物体的田间释放试验后分析野生种群，因为它可以有效地确定将转基因引入本地种群的频率以及种群内嵌体的产生接近实时。由于ddPCR的周转时间很快，如果当地有可用的材料，每周在现场试验区域进行抽样和分析人口是可行的。在远程实验室中，购买、进口和设置ddPCR设备的启动成本将很高，但是当野生种群正在从驱动系统进行修改时，能够严格评估野生种群的好处将证明成本是合理的。
Disclosures
作者没有披露。
Acknowledgments
资金由加州大学欧文分校疟疾倡议提供。AAJ是加州大学欧文分校的Donald Bren教授。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863024 | |
| DNA extraction reagent (e.g. Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| EDTA (pH 8.0) | Invitrogen | AM9260G | |
| Ethanol, 200 Proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| Isopropanol (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | A416-500 | |
| Nuclei Lysis Solution (NLS) (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| PCR-grade Water | Any certified PCR-grade water can be used | ||
| Protein Precipitation Solution (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
| Proteinase K 20 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
| Materials | |||
| ddPCR 96-Well Plate | Bio-Rad | 12001925 | |
| Droplet Generator DG8 Cartridge and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| Droplet Generation Oil for probes | Bio-Rad | 1863005 | |
| Fluorescent probes (e.g. FAM/HEX probes) | Sigma-Aldrich | N/A | Probes are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
| Forward and Reverse oligonucleotide primers | Sigma-Aldrich | N/A | Primers are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
| Equipment | |||
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851148 | Can use other Thermo cycler with gradient function and deep well |
References
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