Summary

Biyolüminesans Görüntüleme Kullanan Farelerde İdrar Yolu Enfeksiyonlarının Boyuna Takibi ve Tedavileri

Published: June 14, 2021
doi:

Summary

Bu makalede, farelerde idrar yolu enfeksiyonuna neden olacak lüks bir operon ile üropatojenik bakterilerin intravesik yönetimi ve daha sonra biyolüminesans görüntüleme kullanılarak bakteri yükünün uzunlamasına in vivo analizi açıklanmaktadır.

Abstract

İdrar yolu enfeksiyonları (UTI) insanlarda en sık görülen bakteriyel enfeksiyonlar arasında yer almaktadır ve rutin olarak ampirik antibiyotiklerle tedavi edilmektedir. Bununla birlikte, artan mikrobiyal direnç nedeniyle, en çok kullanılan antibiyotiklerin etkinliği azaldı. Alternatif tedavi seçenekleri bulmak için, UTI patogenezinin ve UTI duyarlılığını belirleyen mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına büyük ihtiyaç vardır. Bunu bir hayvan modelinde araştırmak için, UTI’nin seyrini incelemek için tekrarlanabilir, invaziv olmayan bir test vazgeçilmezdir.

Yıllardır, bakteri yükünün numaralandırması için altın standart, belirli bir numune hacmi için Koloni Şekillendirme Birimlerinin (CFU) belirlenmesi olmuştur. Bu teknik, ölüm sonrası organ homojenasyonları ve seri seyreltmeler gerektirir, veri çıkışını ve tekrarlanabilirliği sınırlar. Alternatif olarak, biyolüminesans görüntüleme (BLI) bakteri yükünü belirlemek için popülerlik kazanıyor. Patojenlerin lüks bir operon ile etiketlenmesi, hassas algılama ve nicelemenin invaziv olmayan bir şekilde sağlanmasına izin verir, böylece boyuna takip sağlar. Şimdiye kadar, UTI araştırmalarında BLI’nin benimsenmesi sınırlı olmaya devam ediyor.

Bu makalede fare idrar yolu enfeksiyon modelinde BLI’nin pratik uygulaması açıklanmaktadır. Burada bakterileri kültleme, intravesik aşılama ve görüntüleme için adım adım bir rehber sağlanmaktadır. CFU ile in vivo korelasyon incelenir ve tedavi edilmemiş enfekte hayvanların bakteri yükünün antibiyotikle tedavi edilen hayvanlarla karşılaştırılmasıyla bir kavram kanıtı sağlanır. Ayrıca, bir in vivo UTI modelinde BLI uygulamasına özgü avantajlar, sınırlamalar ve hususlar tartışılmıştır. BLI’nin UTI araştırma alanında uygulanması, UTI patogenezinin araştırılmasını ve UTI’yi önlemenin ve tedavi etmenin yeni yollarının keşfedilmesini büyük ölçüde kolaylaştıracaktır.

Introduction

İdrar yolu enfeksiyonları (UTI) insanlarda en sık görülen bakteriyel enfeksiyonlar arasındadır. Tüm kadınların neredeyse yarısı yaşamları boyunca semptomatik bir UTI yaşayacaktır1. Mesane ile sınırlı enfeksiyonlar idrar sıklığında artış, aciliyet, hematüri, idrar kaçırma ve ağrı gibi idrar semptomlarına yol açabilir. Enfeksiyon üst idrar yoluna yükseldiğinde, hastalar halsizlik, ateş, titreme ve sırt ağrısı ile pyelonenfrit geliştirir. Ayrıca, UTI’li hastaların% 20’sine kadarı tekrarlayan enfeksiyonlardan muzdariptir ve antibiyotik duyarlılığında dramatik bir azalmaya neden olan2,3,4. Son yıllarda, tekrarlayan UTI’nin tedavisi ve önlenmesi için yeni tedavilere ilgi artmaktadır. Alt idrar yollarının doğuştan gelen ve uyarlanabilir bağışıklığının ve istila ve kolonileşme için gerekli bakteriyel virülans faktörlerinin daha iyi anlaşılmasına rağmen, tedavi rejiminde radikal bir değişiklik günlük ürolojik uygulamaya çevrilmemiştir2. UTI patogenezini ve duyarlılığını vivoincelemek için tekrarlanabilir ve invaziv olmayan bir test vazgeçilmezdir.

Nematodlardan primatlara kadar birçok hayvan UTI modeli tanımlanmıştır, ancak murine modeli ağırlıklı olarak5,6. Bu model, (dişi) farelerin transüretral kateterizasyonu ve daha sonra bakteriyel süspansiyonun, en yaygın olarak üropatojenik Escherichia coli’nin (UPEC), doğrudan mesane lümenine7. Aşılamadan sonra, bakteri yükü geleneksel olarak koloni şekillendirme üniteleri (CFU) belirlenerek ölçülmüştir. Bu teknik, hayvanların ölüm sonrası organ homojenatları ve seri seyreltmeler elde etmesini, veri çıkışını ve tekrarlanabilirliğini sınırlamasını gerektirir. Ayrıca, bireysel hayvanlarda bakteri yükünün boyuna takibi bu teknik kullanılarak mümkün değildir.

1995 yılında Contag ve arkadaşları, canlı hayvanlarda hastalık süreçlerini izlemek için biyolüminesan etiketli patojenlerin kullanılmasınıönerdi 8,9. O zamandan beri, biyolüminesans görüntüleme (BLI) menenjit, endokardit, osteomiyelit, cilt ve yumuşak doku enfeksiyonları gibi çok sayıda enfeksiyon modeline uygulanmıştır10,11,12. Murine UTI modelinde, Photorhabdus lüminesanslarından tam lüks operon (luxCDABE) ile bir UPEC suşukullanılabilir 13. Enzymatic reaksiyon, oksijen varlığında azaltılmış flavin mononükleotid ile reaksiyona giren uzun zincirli aldehitlerin oksidasyonuna bağlı olan bakteriyel luciferaz tarafından katalize edilir, oksitlenmiş flavin, uzun zincirli bir yağ asidi ve ışık12verir. Lüks operon, luciferaz ve substratların sentezi için gerekli diğer enzimler için kodlar. Bu nedenle, metabolik olarak aktif olan tüm bakteriler, eksojen bir substratın enjeksiyonuna gerek kalmadan sürekli olarak mavi yeşil (490 nm) ışık yayar12. Lüksetiketli bakterilerin yaydığı fotonlar, son derece hassas, soğutulmuş şarj bağlantılı cihaz (CCD) kameralar kullanılarak yakalanabilir.

Biyolüminesan bakterilerin UTI için bir modelde kullanılması, bakteri yükünün boyuna, invaziv olmayan niceliğine izin verir ve CFU tayini için takip sırasında sabit zaman noktalarında hayvanları kurban etme ihtiyacını atlar. Bu BLI tekniğinin diğer alanlardaki sağlamlığı ve klasik UTI modellerine göre avantajları için kanıt biriktiren çok çeşitli olanaklara rağmen, UTI araştırmasında yaygın olarak uygulanmamıştır. Burada sunulan protokol, ayrıntılı bir adım adım kılavuz sağlar ve BLI’nin gelecekteki tüm UTI araştırmaları için avantajlarını vurgular.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri Avrupa Birliği Toplum Konseyi yönergelerine uygun olarak yapılmış ve KU Leuven Hayvan Etik Komitesi (P158/2018) tarafından onaylanmıştır. 1. Kült bakteriler(7,13,14’tenuyarlanmıştır) Hazırlık Deneysel ihtiyaçlara en uygun parlak upec suşu seçin.NOT: Burada, klinik sistit izole, UTI89 (E. coli), hem insanlarda hem de kemirgenlerde ?…

Representative Results

In vivo BLI, aşılama anında inoculumun CFU’su ile ilişkilidir.Vivo BLI’nin algılama sınırını ve inoculumun CFU ile korelasyonunu değerlendirmek için, farelere negatif kontrol olarak farklı UTI89-lux ve PBS konsantrasyonları bulaştı. Aşılamadan önce, enfekte olmayan hayvanlar arka plan lüminesansını belirlemek için tarandı. Sonraki görüntüler aşılamadan hemen sonra elde edildi (Şekil 1A). UTI89-…

Discussion

BLI’nin CFU sayılarına göre avantajları
Boyuna veriler
Mikrobiyal yükü ölçmek için geleneksel CFU sayma yönteminin en büyük dezavantajı, hayvan başına sadece bir kesitsel veri noktası sağlayan ölüm sonrası organ homojenatlarının gereksinimidir. Tersine, BLI enfekte hayvanların invaziv olmayan boyuna takibini sağlar. Hayvanlar günde 2 ila 3 kez görüntülenebilir ve enfeksiyonun kinetiği hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Ek olarak, aynı hayvanın tekrarlanan …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Araştırma Vakfı tarafından desteklendi – Flanders (FWO Vlaanderen; G0A6113N), KU Leuven Araştırma Konseyi (C1-TRPLe; T.V. ve W.E.) ve VIB (T.V.’ye). W.E., Flanders (FWO Vlaanderen) Araştırma Vakfı’nın kıdemli klinik araştırmacısıdır. UTI89-lux türü, Prof. Seed’in laboratuvarından cömert bir hediyeydi13.

Materials

96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate Corning 3925 for in vitro imaging
Aesculap ISIS Aesculap GT421 hair trimmer, with GT608 cap
Anesthesia vaporizer Harvard apparatus limited N/A https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
Baytril 100 mg/mL Bayer N/A Enrofloxacin
BD Insyte Autoguard 24 GA BD 382912 Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation
C57Bl/6J mice Janvier N/A
Centrifuge 5804R Eppendorf EP022628146
Dropsense 16 Unchained Labs Trinean to measure OD 600nm
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco ThermoFisher Scientific REF 14040-083
Ethanol 70% denaturated 5L VWR international 85825360
Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap Corning 352057
Falcon 50ml cellstart Greiner 227285
Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL Sigma-Aldrich 26203 to ensure slow bacterial instillation of 50 µL
Inoculation loop Roth 6174.1 holder: Art. No. 6189.1
Iso-Vet 1000mg/g Dechra Veterinary products N/A Isoflurane
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System PerkinElmer REF 124262 imaging device
Kanamycine solution 50 mg/mL Sigma-Aldrich CAS 25389-94-0
Living Imaging Software PerkinElmer N/A BLI acquisition software, version 4.7.3
Luria Bertani Broth Sigma-Aldrich REF L3022 alternatively can be made
Luria Bertani Broth with agar Sigma-Aldrich REF L2897 alternatively can be made
Petri dish Sterilin 90mm ThermoFisher Scientific 101VR20 to fill with LB agar supplemented with Km
Pyrex Culture flask 250 mL Sigma-Aldrich SLW1141/08-20EA
Slide 200 Trinean Unchained Labs 701-2007 to measure OD 600nm
UTI89-lux N/A N/A Generous gift from Prof. Seed
Vortex VWR international 444-1372

References

  1. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).
  2. O’Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections. Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).
  3. Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. Host-pathogen interactions in urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).
  4. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
  5. Carey, A. J., et al. Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations. Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).
  6. Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).
  7. Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).
  8. Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).
  9. Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature Medicine. 4 (2), 245-247 (1998).
  10. Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).
  11. Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).
  12. Avci, P., et al. In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging. Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).
  13. Balsara, Z. R., et al. Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder. Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).
  14. Huang, Y. Y., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model. Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).
  15. Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
  16. Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A murine model for E. coli urinary tract infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).
  17. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).
  18. Zhang, Y., et al. Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis. Infectious Microbes & Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).
  19. Vanherp, L., et al. Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis. Disease Models & Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).
  20. Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).
  21. Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).
  22. Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).
  23. Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).
  24. Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).
  25. Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).

Play Video

Cite This Article
Luyts, N., Vande Velde, G., Vanneste, M., De Bruyn, H., Janssens, A., Verstraeten, N., Voets, T., Everaerts, W. Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (172), e62614, doi:10.3791/62614 (2021).

View Video