Tüm Mount Nöromüsküler Kavşakların İmmünofluoresan ve Morfometrik Analizleri için Tek İskelet Kas Liflerinin Diseksiyonu
Summary
Nöromüsküler kavşak bileşenlerini doğru bir şekilde tespit edebilme yeteneği, patolojik veya gelişimsel süreçler nedeniyle mimarisindeki değişikliklerin değerlendirilmesinde çok önemlidir. Burada, nicel ölçümler yapmak için kullanılabilecek tam montajlı nöromüsküler kavşakların yüksek kaliteli görüntülerini elde etmek için basit bir yöntemin tam bir açıklamasını sunuyoruz.
Abstract
Nöromüsküler kavşak (NMJ), motor sinir ve iskelet kası arasında özel bir temas noktasıdır. Bu periferik sinaps yüksek morfolojik ve fonksiyonel plastisite sergiler. Çok sayıda sinir sistemi bozukluğunda, NMJ nörotransmisyon yetmezliği, halsizlik, atrofi ve hatta kas lifi ölümü ile sonuçlanan erken patolojik bir hedeftir. İlgisi nedeniyle, NMJ bileşenleri arasındaki ilişkinin belirli yönlerini nicel olarak değerlendirme imkanı, montajı/sökülmesi ile ilişkili süreçlerin anlaşılmasına yardımcı olabilir. Kaslarla çalışırken ilk engel, liflerine zarar vermeden hızlı bir şekilde tanımlamak ve parçalamak için teknik uzmanlık kazanmaktır. İkinci zorluk, nicel analiz yapmak için kullanılabilecek NMJ görüntülerini elde etmek için yüksek kaliteli algılama yöntemlerini kullanmaktır. Bu makalede, sıçanlardan ekstansor digitorum longus ve soleus kaslarının diseksiyonu için adım adım bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, immünofluoresansın tüm montajlı NMJ’lerin pre ve postsinaptik unsurlarını görselleştirmek için kullanımını açıklar. Elde edilen sonuçlar, bu tekniğin sinapsın mikroskobik anatomisini oluşturmak ve fizyolojik veya patolojik koşullar altında bazı bileşenlerinin durumundaki ince değişiklikleri tanımlamak için kullanılabileceğini göstermektedir.
Introduction
Memeli nöromüsküler kavşak (NMJ), motor nöron sinir uçlarından, iskelet kas lifi üzerindeki postsinaptik zardan ve terminal Schwann hücrelerinden oluşan büyük bir kolinerjik üçlüsinapstır. Bu sinaps, NMJ’lerin dinamik yapısal değişikliklere uğrayabildiği yetişkinlik döneminde bile yüksek morfolojik ve fonksiyonel plastisite4,5,6,7,8sergiler. Örneğin, bazı araştırmacılar motor sinir uçlarının mikrometre ölçeğinde şekillerini sürekli olarak değiştirdiğini göstermiştir9. Ayrıca, NMJ’nin morfolojisinin fonksiyonel gereksinimlere, değiştirilmiş kullanıma, yaşlanmaya, egzersize veya lokomotor aktivite4, 10 , 11,12,13,14,15varyasyonlarına yanıt verdiği bildirilmiştir. Bu nedenle, eğitim ve kullanım eksikliği, NMJ’nin boyutu, uzunluğu, sinaptik veziküllerin ve reseptörlerin dağılımı ve ayrıca sinir terminalidallanma 14 , 16 , 17 ,18,19,20gibi bazı özelliklerini değiştirmek için gerekli uyaranı temsil eder.
Ayrıca, bu hayati bağlantının herhangi bir yapısal değişiminin veya dejenerasyonun motor nöron hücre ölümü ve kas atrofisi21ile sonuçlanabileceği gösterilmiştir. Ayrıca, sinirler ve kaslar arasındaki değişen iletişimin fizyolojik yaşa bağlı NMJ değişikliklerinden ve muhtemelen patolojik durumlardaki yıkımından sorumlu olabileceği düşünülmektedir. Nöromüsküler kavşak sökümü, bozulmuş kas-sinir etkileşiminin en iyi örneklerinden birini oluşturan nörodejeneratif bir hastalık olan Amyotrofik Lateral Sklerozun (ALS) başlangıcında çok önemli bir rol oynar3. Motor nöron disfonksiyonu üzerinde yapılan çok sayıda çalışmaya rağmen, ALS’de gözlenen bozulmanın motor nörona doğrudan zarar ve daha sonra kortiko-spinal projeksiyonlara kadar uzanıp uzanmadığı hala tartışılır22; veya sinir uçlarında dejenerasyonun başladığı ve motor nöron somas23,24’edoğru ilerlediği distal bir aksonopati olarak düşünülmelidir. ALS patolojisinin karmaşıklığı göz önüne alındığında, bağımsız süreçlerin bir karışımının meydana geldiğini düşünmek mantıklıdır. NMJ, kas ve sinir arasındaki fizyopatolojik etkileşimin merkezi oyuncusu olduğundan, istikrarsızlaşması, hastalığın kökeninde analiz edilmesi gereken önemli bir noktayı temsil eder.
Memeli nöromüsküler sistemi, işlevsel olarak bir motor nörondan ve sinir terminali tarafından özel olarak içselleştirilen kas liflerinden oluşan ayrı motor birimler halinde düzenlenir. Her motor ünitesi benzer veya özdeş yapısal ve fonksiyonel özelliklere sahip liflere sahiptir25. Motor nöron seçici işe alım fonksiyonel taleplere kas yanıtını optimize etmeyi sağlar. Şimdi memeli iskelet kaslarının dört farklı lif türünden oluştuğu açıktır. Bazı kaslar en bol lif tiplerinin özelliklerine göre adlandırılır. Örneğin, soleus (vücut duruşunun korunmasında rol oynayan arka uzvun arka kası) yavaş seğirme birimlerinin (tip 1) çoğunluğunu taşır ve yavaş bir kas olarak kabul edilir. Bunun yerine, ekstansör digitorum longus (EDL) esasen benzer hızlı seğirme özelliklerine (tip 2 lifler) sahip ünitelerden oluşur ve hareketlilik için gerekli olan fazik hareketler için uzmanlaşmış hızlı bir kas olarak bilinir. Başka bir deyişle, yetişkin kasları hormonal ve sinirsel etkiler nedeniyle doğada plastik olmasına rağmen, lif bileşimi, sürekli düşük yoğunluklu aktivite ve daha hızlı bir tek seğirme sergileyen EDL yaşayan soleusta görüldüğü gibi farklı aktiviteler gerçekleştirme kapasitesini belirler. Farklı kas lifleri arasında değişken olan diğer özellikler yapıları (mitokondriyal içerik, sarkoplazmik retikülün uzantısı, Z hattının kalınlığı), miyozin ATPase içeriği ve miyozin ağır zincir bileşimi26 , 27,28,29ileilgilidir.
Kemirgen NMJ’leri için, kaslar arasında önemli farklılıklar vardır28,29. Sıçanlardan soleus ve EDL’de yapılan morfometrik analizler, sinaptik alan ile lif çapı arasında pozitif bir korelasyon olduğunu ortaya koydu (yani, soleus yavaş liflerdeki sinaptik alan EDL hızlı liflerden daha büyüktür) ancak NMJ alanı ile lif büyüklüğü arasındaki oran her iki kasta da benzerdir30,31. Ayrıca, sinir terminalleri ile ilgili olarak, tip 1 liflerdeki uç mutlak alanlar tip 2 liflere göre daha düşükken, lif çapı ile normalleşme, tip 1 liflerdeki sinir terminallerinin alanlarını en büyük32yaptı.
Bununla birlikte, çok az çalışma, bazı NMJ bileşenlerindeki değişikliklerin kanıtlarını göstermek için morfometrik analize odaklanmaktadır33,34. Bu nedenle, morfolojisi ve fizyolojisi çeşitli patolojilerde değişen organizmanın işlevinde NMJ’nin ilgisi nedeniyle, farklı kas türlerinin diseksiyon protokollerini tüm NMJ yapısının görselleştirilmesine izin sağlayacak kalitede optimize etmek önemlidir. Yaşlanma veya egzersiz 35 , 36,37,38gibi farklı deneysel durumlarda veya koşullarda pre veya postynaptik değişikliklerin oluşumunu değerlendirmek de gereklidir. Ek olarak, ALS39’dabildirildiği gibi terminal sinir uçlarında değiştirilmiş nörofilament fosforilasyon gibi NMJ bileşenlerinde daha ince değişikliklere kanıt sağlamak yararlı olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, NMJ değişikliklerinin yanı sıra montaj/sökme süreçlerini nicel olarak değerlendirmek için iki sıçan iskelet kasının (biri yavaş seğirme ve diğeri hızlı seğirme), fiber kas izolasyonu ve pre ve postynaptik belirteçlerin immünofluoresans tespiti için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu tür bir protokol kemirgen modellerinde yararlı olabilir41,42 fizyolojik veya patolojik süreçler sırasında NMJ’yi değerlendirmek için als…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu işe verilen mali destek için CSIC ve PEDECIBA’ya çok teşekkürler; el yazması düzeltmeleri için Natalia Rosano’ya; Marcelo Casacuberta’ya videoyu çekene ve Nicolás Bolatto’ya sesini ödünç verdiği için.
Materials
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ-10A | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Premium (Plus) microscope slides | PORLAB | PC-201-16 | |
| Tweezers | F.S.T | 11253-20 | |
| Uniband LA-4C Scissors 125mm | E.M.S | 77910-26 | |
| Disponsable surgical blades #10 | Sakira Medical | 1567 | |
| Disponsable sterile syringe (1 ml) | Sakira Medical | 1569 | |
| Super PAP pen | E.M.S | 71310 | |
| 100 μl or 200 μl pipette | Finnpipette | 9400130 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 – AiryScan | |
| NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats | Taconic | 2148-M | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Amresco | 167 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody | BioLegend | 801601 | Previously Covance # SMI 31P |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody | BioLegend | 801701 | Previously Covance # SMI-32P |
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L) | Thermo Scientific | A11029 | |
| α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate | Invitrogen | B1196 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | S32355 | |
| Diaminophenylindole (DAPI) | Sigma | D8417 |
References
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).
- Robitaille, R. Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neuromuscular junction. Neuron. 21, 847-855 (1998).
- Cappello, V., Francolini, M. Neuromuscular Junction Dismantling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2092-2108 (2017).
- Deschenes, M. R., Tenny, K. A., Wilson, M. H. Increased and decreased activity elicits specific morphological adaptations of the neuromuscular junctions. 신경과학. 137, 1277-1283 (2006).
- Desaulniers, P., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Habitual exercise enhances neuromuscular transmission efficacy of rat soleus muscle in situ. Journal Applied Physiology. 90, 1041-1048 (2001).
- Deschenes, M. R., Roby, M. A., Glass, E. K. Aging influences adaptations of the neuromuscular junction to endurance training. 신경과학. 190, 56-66 (2011).
- Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proceedings National Academy of Science U.S.A. 107, 14863-14868 (2010).
- Arnold, A. -. S., et al. Morphological and functional remodeling of the neuromuscular junction by skeletal muscle PGC-1α. Nature Communications. 5, 3569-3595 (2014).
- Hill, R. R., Robbins, N., Fang, Z. P. Plasticity of presynaptic and postsynaptic elements of neuromuscular junctions repeatedly observed in living adult mice. Journal of Neurocytology. 20 (3), 165-182 (1991).
- Brown, M. C., Hopkins, W. G., Keynes, R. J., White, J. A comparison of early morphological changes at denervated and paralyzed endplates in fast and slow muscles of the mouse. Brain Research. 248, 382-386 (1982).
- Rosenheimer, J. L. Effects of chronic stress and exercise on age related changes in end-plates architecture. Journal of Neurophysiology. 53, 1582-1589 (1985).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Effects of endurance exercise on the morphology of mouse neuromuscular junctions during ageing. Journal of Neurocytology. 16, 589-599 (1987).
- Tomas, J., Fenoll, R., Santafé, M., Batlle, J., Mayayo, E. Motor nerve terminal morphologic plasticity induced by small changes in the locomotor activity of the adult rat. Neuroscience Letters. 106, 137-140 (1989).
- Deschenes, M. R., Maresh, C. M., Crivello, J. F., Armstrong, L. E., Kramer, W. J., Covault, J. The effects of exercise training of different intensities on neuromuscular junction morphology. Journal of Neurocytology. 22, 603-615 (1993).
- Nishimune, H., Stanford, J. A., Mori, Y. Role of exercise in maintaining the integrity of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 49 (3), 315-324 (2014).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Endurance exercise alters the morphology of fast- and slow-twitch rat neuromuscular junction. International Journal of Sports Medicine. 9, 218-223 (1988).
- Fahim, M. A. Endurance exercise modulates neuromuscular junction of C57BL6N in ageing mice. Journal of Applied Physiology. 83, 59-66 (1997).
- Waerhaug, O., Dahl, H. A., Kardel, K. Different effects of physical training on morphology of motor nerve terminals in rat extensor digitorum longus and soleus muscles. Anatomy and Embryology. 186, 125-128 (1992).
- Desaulniers, M. R., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Endurance training increases acetylcholine receptor quantity at neuromuscular junctions of adult rat skeletal muscle. Neuroreport. 9, 3549-3552 (1998).
- Deschenes, M. R., et al. Effects of resistance training on neuromuscular junction morphology. Muscle Nerve. 23, 1576-1581 (2000).
- Lepore, E., Casola, I., Dobrowolny, G., Musarò, A. Neuromuscular Junction as an Entity of Nerve-Muscle Communication. Cells. 8 (8), 906-921 (2019).
- Braak, H., et al. Amyotrophic lateral sclerosis-A model of corticofugal axonal spread. Nature Review Neurology. 9, 708-714 (2013).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185, 232-240 (2004).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Frontiers in Neuroscience. 14 (8), 252-270 (2014).
- Scott, W., Stevens, J., Binder-Macleod, S. A. Human skeletal muscle fiber type classifications. Physical Therapy. 81, 1810-1816 (2001).
- Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobo, S. Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers. Journal of Cellular Biology. 47 (1), 107-119 (1970).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Review. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Mech, A. M., Brown, A. L., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Morphological variability is greater at developing than mature mouse neuromuscular junctions. Journal of Anatomy. 237 (4), 603-617 (2020).
- Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biology. 6 (12), 160240 (2016).
- Waerhaug, O., Lømo, T. Factors causing different properties at neuromuscular junctions in fast and slow rat skeletal muscles. Anatomy and Embryology. 190, 113-125 (1994).
- Wood, S. J., Slater, C. R. The contribution of postsynaptic folds to the safety factor for neuromuscular transmission in rat fast- and slow-twitch muscles. Journal of Physiology. 500, 165-176 (1997).
- Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. Journal of Neurocytology. 25, 88-100 (1996).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscular Disorders. 20 (11), 740-743 (2010).
- Mejia Maza, A., et al. NMJ-Analyser: high-throughput morphological screening of neuromuscular junctions identifies subtle changes in mouse neuromuscular disease models. bioRxiv. , (2020).
- Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments. (135), e57482 (2018).
- Franco, J. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S., Wilkinson, K. A. An in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents. Journal of Visualized Experiments. (91), e51948 (2014).
- Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments. (71), e4460 (2013).
- Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis. Journal of Visualized Experiments. (83), e51162 (2014).
- Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non-phosphorylated neurofilaments: cross-species comparison and alterations in ALS. Brain Research. 861 (1), 45-58 (2000).
- Balice-Gordon, R. J., Thomposon, W. J. The organization and development of compartmentalized innervation in rat extensor digitorum longus muscle. Journal of Physiology. 398, 211-231 (1988).
- Cipriani, S., et al. Neuromuscular junction changes in a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 4C. International Journal of Molecular Science. 19 (12), 4072 (2018).
- Boido, M., Vercelli, A. Neuromuscular junctions as key contributors and therapeutic targets in spinal muscular atrophy. Frontiers in Neuroanatomy. 10 (6), (2016).
- Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. -. C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. Journal of Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).
