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Bioengineering

वनपॉट शुद्ध सेल-फ्री सिस्टम

Published: June 23, 2021 doi: 10.3791/62625
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Institute of Bioengineering, School of Engineering, École Polytechnique Fédérale de Lausanne
* These authors contributed equally

Summary

हम मानक प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके पुनर्संयोजन शुद्ध सेल-मुक्त टीएक्स-टीएल प्रणाली का उत्पादन करने के लिए एक तेज और लागत प्रभावी विधि पेश करते हैं।

Abstract

परिभाषित शुद्ध (प्रोटीन संश्लेषण पुनर्संयोजन तत्वों का उपयोग कर) ट्रांसक्रिप्शन-अनुवाद प्रणाली सेल-मुक्त सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए एक आकर्षक चेसिस प्रदान करती है। दुर्भाग्य से, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणालियां महंगी हैं, और उनकी ट्यूनेबिलिटी सीमित है। इसकी तुलना में, उपयोगकर्ता की जरूरतों के आधार पर घर में बने दृष्टिकोण को अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि, घर में बने सिस्टम को तैयार करने में रिबोसोम्स के साथ-साथ 36 मध्यम पैमाने पर प्रोटीन शुद्धिकरण की आवश्यकता के कारण समय लेने वाला और दुरूह होता है। कोक्यूल्चरिंग और सह-शुद्धिकरण द्वारा प्रोटीन शुद्धिकरण को सुव्यवस्थित करना समय और श्रम आवश्यकताओं को कम करने की अनुमति देता है। यहां, हम मानक प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके 1 सप्ताह के भीतर सभी शुद्ध प्रणाली घटकों का उत्पादन करने के लिए एक आसान, समायोज्य, समय और लागत प्रभावी विधि प्रस्तुत करते हैं। इसके अलावा, वनपॉट प्योर का प्रदर्शन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणालियों के बराबर है। वनपॉट शुद्ध तैयारी विधि अपनी सादगी और लागत प्रभावशीलता के कारण शुद्ध प्रणाली की पहुंच को अधिक प्रयोगशालाओं में विस्तारित करती है।

Introduction

सेल-फ्री ट्रांसक्रिप्शन-ट्रांसलेशन (टीएक्स-टीएल) सिस्टम जांच और इंजीनियरिंग जैविक प्रणालियों के लिए एक आशाजनक मंच का गठन करते हैं। वे सरलीकृत और ट्यूनेबल प्रतिक्रिया की स्थिति प्रदान करते हैं, क्योंकि वे अब विकास, हो्योस्टेसिस या नियामक तंत्र1सहित जीवन को बनाए रखने वाली प्रक्रियाओं पर भरोसा नहीं करते हैं। इस प्रकार, यह अनुमान लगाया गया है कि सेल-मुक्त प्रणालियां बायोमॉलिक्यूलर सिस्टम की जांच में योगदान देंगी, तर्कसंगत बायोडिजाइन रणनीतियों2का परीक्षण करने के लिए एक ढांचा प्रदान करेंगी, और भविष्य के सिंथेटिक सेल3,4के लिए चेसिस प्रदानकरेंगी। पूरी तरह से पुनः संयोजन शुद्ध प्रणाली अपनी परिभाषित और न्यूनतम संरचना के कारण एक विशेष रूप से आकर्षक चेसिस प्रदान करती है, साथ ही इसकी समायोज्यता और ट्यूनेबिलिटी5भी प्रदान करती है।

चूंकि पहली कार्यात्मक, पूरी तरह से पुनः संयोजन शुद्ध प्रणाली 20015में स्थापित की गई थी, इसलिए सिस्टम की सीमाओं का विस्तार करने और सिस्टम की संरचना को अनुकूलित करने के प्रयास किए गए हैं ताकि सिस्टम की पैदावार6,7, 8हो सके, ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन9,झिल्ली10,11 और गुप्त प्रोटीन संश्लेषण12के लिए अनुमति दी जा सके, और प्रोटीन तह13,14 की सुविधा प्रदान की जा सके . आजकल, तीन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिस्टम हैं: PUREfrex (GeneFrontier), PURExpress (NEB), और मैजिक प्योर (क्रिएटिव बायोलैब)। हालांकि, वे प्रणालियां महंगी हैं, उनकी सटीक संरचना मालिकाना है और इस प्रकार अज्ञात है, और अनुकूलनशीलता सीमित है।

घर में तैयार शुद्ध प्रणालियां सबसे अधिक लागत प्रभावी और ट्यूनेबल विकल्प15,16साबित हुईं । हालांकि, प्रोटीन और राइबोसोम अंशों के लिए आवश्यक 37 शुद्धि कदम समय लेने वाले और थकाऊ हैं। शुद्ध प्रणालीतैयारकरने की कार्यकुशलता में सुधार लाने के लिए कई प्रयास किए गएहैं. हमने हाल ही में प्रदर्शन किया है कि शुद्ध प्रणाली में मौजूद सभी आवश्यक गैर-राइबोसोमल प्रोटीन को सह-शुद्ध करना और सह-शुद्ध करना संभव है। यह OnePot विधि लागत प्रभावी और समय कुशल साबित हुई है, जो कई हफ्तों से 3 कार्य दिवसों तक तैयारी के समय को काट रही है। यह दृष्टिकोण एक शुद्ध प्रणाली उत्पन्न करता है जिसमें प्रोटीन उत्पादन क्षमता व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्यूरएक्सप्रेस सिस्टम20के बराबर होती है । शुद्ध तैयारी को सरल बनाने के लिए पिछले दृष्टिकोणों के विपरीत17,18,19,वनपॉट दृष्टिकोण में सभी प्रोटीन अभी भी अलग-अलग उपभेदों में व्यक्त किए जाते हैं। यह उपयोगकर्ता को केवल विशिष्ट उपभेदों को छोड़कर या जोड़ने या टीका मात्रा को समायोजित करके वनपॉट शुद्ध प्रणाली की संरचना को ट्यून करने में सक्षम बनाता है, इस प्रकार ड्रॉपआउट शुद्ध सिस्टम उत्पन्न करता है या क्रमशः अंतिम प्रोटीन अनुपात में फेरबदल करता है।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल पहले20वर्णित वनपॉट शुद्ध प्रणाली बनाने के लिए एक विस्तृत विधि प्रदान करता है, हालांकि β-मर्केप्टोथेनॉल को ट्राइ (2-कार्बोक्सिएथिल) फॉस्फिन (टीएमईपी) के साथ प्रतिस्थापित किया गया था। इसके अलावा, राइबोसोम शुद्धिकरण के लिए दो तरीकों का वर्णन किया गया है: हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन और सुक्रोज कुशन का उपयोग करके पारंपरिक टैग-मुक्त राइबोसोम शुद्धिकरण, शिमिज़ू एट अल15से अनुकूलित, और नी-एनटीए राइबोसोम शुद्धि वांग एट अल के आधार पर18 और ईडरथ एट अल21 लेकिन काफी संशोधित। उत्तरार्द्ध विधि आगे शुद्ध प्रणाली की तैयारी की सुविधा प्रदान करती है और इसे अधिक प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ बनाती है, क्योंकि केवल मानक प्रयोगशाला उपकरण की आवश्यकता होती है।

प्रायोगिक प्रोटोकॉल एक सरल, ट्यून करने योग्य, लागत प्रभावी सेल-मुक्त मंच प्रदान करने के लिए एक बहुमुखी शुद्ध सेल-मुक्त TX-TL प्रणाली की तैयारी का सारांश देता है, जिसे एक सप्ताह के भीतर मानक प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके तैयार किया जा सकता है। मानक शुद्ध संरचना शुरू करने के अलावा, हम यह इंगित करते हैं कि सिस्टम की कार्यक्षमता सुनिश्चित करने के लिए प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों पर प्राथमिक ध्यान देने के साथ इसे कैसे और कहां समायोजित किया जा सकता है।

Protocol

नोट: यह प्रोटोकॉल पुनर्संयोजन घटकों से सेल-मुक्त टीएक्स-टीएल सिस्टम की तैयारी का वर्णन करता है। सुविधा के लिए यह काम पांच हिस्सों में अलग हो जाता है। पहला भाग तैयारी चरणों का वर्णन करता है, जो प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले किया जाना चाहिए। दूसरा भाग वनपॉट प्रोटीन समाधान की तैयारी का वर्णन करता है। तीसरा भाग राइबोसोम शुद्धि का वर्णन करता है, चौथा भाग ऊर्जा समाधान की तैयारी का विवरण देता है, और अंतिम भाग शुद्ध प्रतिक्रिया स्थापित करने के लिए एक मैनुअल प्रदान करता है। सुविधा के लिए, प्रोटोकॉल दिनों में विभाजित हैं और तालिका 1में दैनिक कार्यक्रम में संक्षेप में प्रस्तुत किए जाते हैं। शेड्यूल के बाद एक व्यक्ति द्वारा 1 सप्ताह में पूरी व्यवस्था तैयार की जा सकती है।

1. प्रारंभिक कार्य

  1. अनुपूरक तालिका 1में वर्णित बैक्टीरियल कल्चर मीडिया और मीडिया सप्लीमेंट तैयार करें । पिपेट टिप्स, 96 डीप-वेल प्लेट्स सहित आवश्यक सामग्रियों को तैयार और स्टरलाइज करें।
  2. तनाव की तैयारी
    1. हीट शॉक विधि का उपयोग करके इसी अभिव्यक्ति वैक्टर के साथ तालिका 2 में इंगित अभिव्यक्ति उपभेदों को बदलें।
      1. रासायनिक रूप से सक्षम बैक्टीरिया में शुद्ध प्लाज्मिड जोड़ें और 20-30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
      2. इस मिश्रण को 30 एस (हीट शॉक) के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर रखें और फिर इसे 2 मिनट के लिए बर्फ पर वापस रखें।
      3. पिपेट बैक्टीरिया के 20 माइक्रोन सीधे एम्पीसिलिन (एएमपी) युक्त आगर प्लेटों पर और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करते हैं। प्लेटों को 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      4. एलबी मीडिया के 3 एमएल को टीका लगाएं जिसमें एएमपी को आगर प्लेटों से बैक्टीरिया की एक कॉलोनी के साथ शामिल किया जाता है। रात 260 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
      5. संस्कृति के 250 माइक्रोन को 50% (v/v) ग्लिसरोल के 250 माइक्रोन के साथ मिलाएं और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
        नोट: भविष्य में तेजी से तैयारी के लिए, ग्लिसेरोल स्टॉक के रूप में 96-अच्छी प्लेट में उपभेदों को स्टोर करें।
    2. कॉलोनी पीसीआर और अनुक्रमण द्वारा सभी वेक्टर परिवर्तनों की पुष्टि करें। जीन, प्रमोटर क्षेत्र, और राइबोसोम बाध्यकारी साइट अनुक्रम।
  3. अभिव्यक्ति परीक्षण
    1. 1.3 एमएल डीप-वेल प्लेट में तैयार ग्लिसरोल स्टॉक के लगभग 1 माइक्रोन के साथ एएमपी युक्त एलबी मीडिया के 300 माइक्रोन को टीका करें। एक सांस झिल्ली के साथ थाली सील और फिर ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट जबकि रात भर २६० आरपीएम पर मिलाते हुए ।
      नोट: सभी भाव इस बिंदु पर अलग से किया जाता है ।
    2. रातोंरात संस्कृतियों के 1 माइक्रोन के साथ एएमपी युक्त ताजा पौंड मीडिया के 300 माइक्रोन टीका। रात 260 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। 2 घंटे के बाद, कोशिकाओं को आइसोप्रोपिल β-डी-1-थिओगालेक्टोपाइरानोसाइड (आईपीटीजी) के 100 माइक्रोन के साथ प्रेरित करें और अतिरिक्त 3 घंटे के लिए बढ़ें।
    3. 2x Laemmli बफर के 10 माइक्रोन के साथ संस्कृति के 10 माइक्रोन और 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस करने के लिए गर्मी मिलाएं। टेबल सेंट्रलाइज का उपयोग करके 1 मिनट के लिए नमूनों को स्पिन करें और पेज जेल पर सुपरनेटेंट के 10 माइक्रोन लोड करें। 30 मिनट के लिए २०० वी पर Tris/Glycine/SDS बफर में जेल चलाएं । इसे डिवोनाइज्ड पानी से अच्छी तरह से कुल्ला करें। 1 घंटे के लिए एक कूमासी प्रोटीन दाग और इनक्यूबेट के साथ जेल को कवर करें। यदि आवश्यक हो तो जेल को पानी में डिदागें (चित्र 1में अभिव्यक्ति परीक्षण के लिए प्रतिनिधि परिणाम)।
      नोट: एक अच्छा अलगाव प्राप्त करने के लिए ढाल (4%-15% या 4%-20%) पेज जैल का उपयोग करें।
  4. आईमैक सेफरोज राल बहाली और सफाई
    1. कॉलम तैयारी।
      1. सेफरोज राल को भंवर से अच्छी तरह मिलाएं।
      2. एक खाली गुरुत्वाकर्षण प्रवाह कॉलम में राल की आवश्यक राशि पिपेट।
        नोट: राल की मात्रा आवश्यक उसकी राइबोसोम शुद्धि और प्रोटीन शुद्धिकरण के बीच भिन्न होती है और संबंधित वर्गों में निर्दिष्ट की जाती है।
      3. राल को 30 एमएल डिवाइनाइज्ड पानी से धोएं।
      4. धारा 1.4.4 में निर्दिष्ट कॉलम री-चार्ज के साथ आगे बढ़ें।
        नोट: अगले चरण के साथ जारी रखने से पहले हमेशा सभी तरल कॉलम के माध्यम से पारित करते हैं। हालांकि, सुनिश्चित करें कि कॉलम कभी सूखा नहीं चलता है। जब भी कॉलम के माध्यम से किसी भी तरल चल रहा है, प्रवाह को रोकने के लिए सुनिश्चित करें या जैसे ही तरल राल तक पहुंचता है अगले कदम के लिए जारी है ।
    2. बहाली।
      1. कॉलम को 30 एमएल डिएकाइज्ड पानी से धोएं।
      2. 0.2 एम ईडीटीए और 0.5 एम एनएसीएल समाधान के 10 एमएल लागू करें।
      3. 0.5 एम एनएसीएल समाधान का 30 एमएल जोड़ें।
      4. कॉलम को 50 एमएल के डिएकाइज्ड पानी से धोएं।
      5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20% (v/v) इथेनॉल में स्टोर करें या अगले चरण के साथ जारी रखें।
    3. प्रक्षालन।
      सावधानी: सुरक्षात्मक उपकरण पहनें।
      1. कॉलम को 0.5 एम नाओएच के 30 एमएल से धोएं।
      2. कॉलम को 30 एमएल डिएकाइज्ड पानी से धोएं।
      3. कॉलम को 0.1 एम एसिटिक एसिड के 30 एमएल से धोएं।
      4. कॉलम को 30 एमएल डिएकाइज्ड पानी से धोएं।
      5. कॉलम को 70% (v/v) इथेनॉल के 30 एमएल से धोएं।
      6. कॉलम को 50 एमएल के डिएकाइज्ड पानी से धोएं।
      7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20% (v/v) इथेनॉल में स्टोर करें या अगले चरण के साथ जारी रखें।
    4. री-चार्ज।
      1. कॉलम में 0.1 एम निकल सल्फेट समाधान का 10 एमएल जोड़ें।
        सावधानी: निकल सल्फेट विषाक्त है। निकल सल्फेट कचरे को आपूर्तिकर्ता द्वारा इंगित सावधानियों के साथ त्यागने की आवश्यकता है।
      2. कॉलम को 50 एमएल के डिएकाइज्ड पानी से धोएं।
      3. 20% ((v/v)) 4 डिग्री सेल्सियस पर इथेनॉल में स्टोर करें या कॉलम संतुलन जारी रखें।
        नोट: यदि कॉलम चरणों के बीच इथेनॉल में संग्रहीत किया जाता है, तो कॉलम को पानी से धोकर इथेनॉल के सभी निशानों को हटाना सुनिश्चित करें।

2. वनपॉट प्रोटीन समाधान अभिव्यक्ति और शुद्धि

नोट: प्रोटोकॉल तीन दिनों में विभाजित भागों के होते है(चित्रा 2)। एक आदर्श तैयारी प्रक्रिया 13.5 मिलीग्राम/एमएल वनपॉट प्रोटीन समाधान का 1.5 एमएल का उत्पादन करती है, जो एक हजार 10 माइक्रोन शुद्ध प्रतिक्रियाओं से मेल खाती है। हालांकि, राशि और समाधान की आदर्श एकाग्रता बैच से बैच में भिन्न होगी। अनुभवी उपयोगकर्ता एक समय में कई OnePot शुद्ध तैयारी कर सकते हैं।

दिन 1:

  1. अनुपूरक तालिका 1में वर्णित बैक्टीरियल कल्चर मीडिया और मीडिया सप्लीमेंट तैयार करें ।
  2. आवश्यक सामग्रियों को तैयार करें और स्टरलाइज करें, जिनमें पिपेट टिप्स, दो 96 डीप-वेल प्लेट्स, और 1 1 एल चकित एर्लेनमेयर फ्लास्क शामिल हैं।
  3. अनुपूरक तालिका 2में वर्णित बफ़र्स और सप्लीमेंट तैयार करें। फ़िल्टर बोतल शीर्ष फिल्टर (0.45 माइक्रोन) का उपयोग करके सभी बफ़र्स को बंद करें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। उपयोग से ठीक पहले 1 एमएम टीएम टीएम टीएम 1सीपी के साथ सभी बफ़र्स को पूरक करें, जब तक कि अन्यथा संकेत न दिया जाए।
  4. वनपॉट प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए सेफरोज राल के 2 एमएल का उपयोग करें। धारा 1.4 में वर्णित कॉलम तैयार करें।
  5. स्टार्टर संस्कृतियों को तैयार करने के लिए, एएमपी के 20 माइक्रोन के साथ एलबी मीडिया के 20 एमएल को मिलाएं। एक बाँझ 96, 1.3 एमएल डीप-वेल प्लेट में, 35 कुओं में मीडिया के 300 माइक्रोन जोड़ें। उनमें से प्रत्येक को अपने संबंधित तनाव के साथ टीका लगाएं, विस्तार कारक थर्मो अस्थिर (ईएफ-टू) को छोड़कर, और प्लेट को सांस लेने योग्य झिल्ली के साथ सील करें।
    नोट: एक ९६-अच्छी तरह से प्रतिकृति का उपयोग कर थाली टीका (सामग्री की मेजदेखें) । गहरी अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से मात्रा और स्टार्टर संस्कृति की मात्रा आवश्यक हैं । बड़े मीडिया की मात्रा या छोटे अच्छी तरह से मात्रा वातारण विसंगतियों के कारण एक अलग जीवाणु घनत्व के लिए नेतृत्व करेंगे ।
  6. ईएफ-टू संस्कृति के लिए, एक स्नैप कैप के साथ 14 एमएल कल्चर ट्यूब में एलबी मीडिया के 3 एमएल को टीका लगाते हैं। ईएफ-टू के लिए संस्कृति का एक एकल 3 एमएल एक वनपॉट अभिव्यक्ति संस्कृति के लिए पर्याप्त है।
  7. रात 260 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।

दूसरा दिन:
नोट: कमरे के तापमान पर सभी चरणों को तब तक करें जब तक कि अन्यथा संकेत न दिया जाए।

  1. एलबी मीडिया के 500 एमएल और बाँझ चकित फ्लास्क में एएमपी के 500 माइक्रोन स्थानांतरित करें।
  2. ईएफ-टू संस्कृति के 1675 माइक्रोन के साथ वनपॉट शुद्ध संस्कृति का टीका 1675 और प्रत्येक संस्कृतियों का 55 माइक्रोन डीप-वेल प्लेट(टेबल 2)से टीका एंव।
    नोट: इस चरण के दौरान, समग्र प्रोटीन संरचना टीका अनुपात ट्यूनिंग द्वारा समायोजित किया जा सकता है । सुनिश्चित करें कि समग्र टीका मात्रा 3.6 एमएल पर स्थिर बनी हुई है।
    वैकल्पिक: पुष्टि करने के लिए कि सभी उपभेदों रातोंरात हो गए हैं, एक थाली पाठक का उपयोग कर एक ९६ अच्छी तरह से थाली में ६०० एनएम (OD६००)पर रातोंरात संस्कृतियों के ऑप्टिकल घनत्व को मापने । ऑप्टिकल घनत्व माप के लिए 10x के एक कमजोर पड़ने का प्रयोग करें।
  3. 260 आरपीएम के झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए संस्कृति को इनक्यूबेट करें, या जब तक कि संस्कृति का ओडी600 0.2-0.3 तक न पहुंच जाता है।
  4. 0.1 m IPTG के 500 माइक्रोन के साथ संस्कृति को प्रेरित करें और अतिरिक्त 3 घंटे के लिए बढ़ें।
  5. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 3220 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को फसल और आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर सेल गोली स्टोर करें।
    नोट: समय को अनुकूलित करने के लिए, 2 दिन(तालिका 1)पर इनक्यूबेशन बार के दौरान धारा 4 में वर्णित ऊर्जा समाधान तैयार करें।

3 दिन:

  1. नीचे दिए गए चरणों में वर्णित शुद्धि के लिए आवश्यक बफ़र्स की मात्रा को मापें और उन सभी को टीएमईपी जोड़ें जैसा कि अनुपूरक तालिका 2में दर्शाया गया है। भविष्य के शुद्धिकरण के लिए टीसीईपी के बिना शेष बफ़र्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. बफर ए के 30 एमएल के साथ आवेशित कॉलम (सेक्शन 2.4) को बराबरी दें। बफर ए के 25 एमएल के बाद, नीचे से कॉलम बंद करें। समानांतर में, चरण 2.15-2.17 के साथ जारी रखें।
  3. कोशिकाओं को गल और बफर ए के 7.5 एमएल में सेल पेलेट को फिर से व्यतीत करने के लिए सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें।
  4. Lyse कोशिकाओं का उपयोग कर एक 130 वाट की जांच ध्वनिक का उपयोग कर (सामग्री की मेजदेखें, जांच टिप व्यास: 6 मिमी) निम्नलिखित मापदंडों के साथ: 4 x 20 एस पल्स पर, 20 एस पल्स बंद, 70% आयाम। यदि सोनीशन सफल होता है, तो समाधान गहरा हो जाएगा(चित्र 2)।
    नोट: सोनीफिकेशन के दौरान कोशिकाओं को बर्फ पर रखना सुनिश्चित करें। ट्यूब को छूने के बिना जांच को समाधान में पर्याप्त गहराई में रखें। यदि बड़ी मात्रा में फोम उत्पन्न होता है, तो ऊर्जा हस्तांतरण को नम किया जाएगा। उस मामले में, फोम को व्यवस्थित होने दें, जांच को समाधान में गहराई से कम करें, और सोनीशन समय का विस्तार करें।
  5. सोनीफिकेशन के तुरंत बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 21130 एक्स जी पर सेंट्रलाइजेशन करके सेल मलबे को हटा दें। बर्फ पर lysate रखें।
  6. समतुल्य स्तंभ में अधिनाट जोड़ें। ऊपर से कॉलम बंद करें और सुनिश्चित करें कि कोई रिसाव नहीं है। ट्यूब रोटेटर का उपयोग करके रोटेशन के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए कॉलम को इनक्यूबेट करें।
  7. कॉलम से एल्यूट अनबाउंड घटक और बफर ए के 25 एमएल के साथ धोएं।
  8. 25 एम एम इमिडाजोल बफर (बफर ए के 23.95 एमएल और बफर बी के 1.25 एमएल) के 25 एमएल के साथ कॉलम धोएं।
  9. 450 m imidazole बफर (बफर ए के 0.5 एमएल और बफर बी के 4.5 एमएल) के 5 एमएल के साथ प्रोटीन को एल्यूट करें। इल्यूटेड प्रोटीन को हर समय बर्फ पर रखें।
  10. एचटी बफर के 25 एमएल के साथ एलुएट को पतला करें, मिश्रण को बर्फ पर रखें। 15 एमएल सेंट्रल फिल्टर में 15 एमएल जोड़ें और 1.5 एमएल की मात्रा में ध्यान केंद्रित करें। शेष 15 एमएल को केंद्रित समाधान के साथ फ़िल्टर में जोड़ें और एक बार फिर 1.5 एमएल पर ध्यान केंद्रित करें।
  11. ध्यान केंद्रित नमूने में एचटी बफर के 10 एमएल जोड़ें और 1 मिलील पर ध्यान केंद्रित करें। स्टॉक बफर बी की बराबर मात्रा जोड़ें और आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: विनिमय/एकाग्रता का एक दौर 4 डिग्री सेल्सियस पर 3220 x ग्राम पर लगभग 60 मिनट घूमता है।
  12. बफर एक्सचेंज के दौरान, सेक्शन 1.4 में निर्दिष्ट कॉलम को बहाल करें।

4 दिन:

  1. आपूर्तिकर्ता द्वारा वर्णित ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता को मापें। 3 केडीए कटऑफ सेंट्रलाइज फिल्टर के 0.5 एमएल से 20 एमजी/एमएल के साथ सैंपल को कंसंट्रेट करें।
    नोट: प्रोटीन समाधान 25 गुना या ५०-एकाग्रता माप से पहले गुना पतला ब्रैडफोर्ड परख oversaturating से बचने के लिए ।
  2. आदर्श प्रोटीन एकाग्रता स्थापित करने के लिए, प्रोटीन समाधान की विभिन्न सांद्रता के साथ इस स्तर (धारा 5.2) पर एक अभिव्यक्ति परीक्षण करें। टिटरेशन करने के लिए, समाधान की कुल मात्रा को स्थिर रखें और स्टॉक बफर बी सहित वनपॉट प्रोटीन समाधान को पांच अलग-अलग अनुपात(अनुपूरक तालिका 7)पर पिपेट करें।
  3. एसडीएस-पेज(चित्रा 3 ए)का उपयोग करके वनपॉट शुद्ध प्रोटीन संरचना को सत्यापित करें। 7.5 माइक्रोन पानी के साथ नमूने के पतला 2.5 माइक्रोन, 2x Laemmli बफर के 10 माइक्रोन के साथ मिश्रण और फिर जेल के लिए नमूनों के 5 μL और 2.5 μL लोड। धारा 1.3.3 में निर्दिष्ट एसडीएस-पेज चलाएं।
  4. अभिव्यक्ति की पुष्टि करने और एकाग्रता को समायोजित करने के बाद प्रोटीन समाधान को 50 माइक्रोन एलिकोट में डालें। आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर OnePot शुद्ध प्रोटीन समाधान स्टोर करें।
    नोट: यदि किसी प्रोटीन घटक के मौजूद नहीं होने का संदेह है, या OnePot शुद्ध में कम से अधिक अपेक्षित एकाग्रता में मौजूद है, तो निम्नलिखित चरणों को करें।
  5. जांच करें कि क्या संबंधित तनाव की रातोंरात संस्कृति सभी संस्कृतियों के ऑप्टिकल घनत्व माप (ओडी600)प्रदर्शन करके अन्य संस्कृतियों के लिए एक तुलनीय दर से बढ़ी है।
  6. संदिग्ध प्रोटीन की अभिव्यक्ति को सत्यापित करने के लिए विशिष्ट तनाव का एक अतिरिक्त अभिव्यक्ति परीक्षण करें।

3. राइबोसोम समाधान

नोट: दो अलग-अलग राइबोसोम शुद्धिकरण रणनीतियां शुरू की जाती हैं, एक षट् षटाहवादी-टैग के लिए और एक गैर-टैग किए गए राइबोसोम्स के लिए। एक मानक आत्मीयता नी-एनटीए गुरुत्वाकर्षण प्रवाह स्तंभ पर उसकी शुद्धि का उपयोग कर शुद्धिकरण विधि का प्रमुख लाभ यह है कि शुद्धिकरण आसान है, तेजी से, और अतिरिक्त प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता नहीं है, जैसे एक FPLC प्रणाली और एक अल्ट्रासेंट्रफ्यूज । हालांकि, वनपॉट शुद्ध प्रतिक्रियाओं में प्रोटीन उत्पादन क्षमता टैग-फ्री राइबोसोम्स की तुलना में लगभग एक तिहाई है। इसलिए, दिए गए आवेदन के लिए उच्च उपज महत्वपूर्ण है या नहीं, इसके आधार पर राइबोसोम उत्पादन के लिए विधि चुनें।

  1. उनके टैग राइबोसोम शुद्धि
    नोट: यह प्रोटोकॉल ई. कोलाई RB1 तनाव, प्रोफेसर वांग (कोलंबिया विश्वविद्यालय, संयुक्त राज्य अमेरिका)18से एक उपहार का उपयोग करता है । इस तनाव में 50 के दशक के राइबोसोमल प्रोटीन (L7/L12) के सी टर्मिनस पर एक षट् षोडसिवादी टैग का जीनोमिक सम्मिलन होता है, जो नी-एनटीए गुरुत्वाकर्षण-प्रवाह कॉलम का उपयोग करके शुद्धि की अनुमति देता है। सामान्य उपज 3.45 माइक्रोन राइबोसोम के लगभग 0.5 एमएल है, जो पांच सौ 10 माइक्रोन शुद्ध प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त है।

दिन 1:

  1. अनुपूरक तालिका 1में वर्णित बैक्टीरियल कल्चर मीडिया और मीडिया सप्लीमेंट तैयार करें ।
  2. आवश्यक सामग्रियों को तैयार करें और स्टरलाइज करें, जिनमें पिपेट टिप्स, वन 5 एल एर्लेनमेयर फ्लास्क, और एक 100 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क शामिल हैं।
  3. अनुपूरक तालिका 2में वर्णित बफ़र्स और सप्लीमेंट तैयार करें। फ़िल्टर बोतल शीर्ष फिल्टर (0.45 माइक्रोन) का उपयोग करके सभी बफ़र्स को बंद कर दें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

दूसरा दिन:

  1. एक कॉलम में राल के 5 एमएल पिपेट और सेक्शन 1.4 में निर्दिष्ट कॉलम तैयार करें।
    नोट: राल की अधिक मात्रा के कारण, बहाली और शुद्धिकरण में काफी समय लगता है। क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए राइबोसोम शुद्धिकरण के लिए एक अलग कॉलम का उपयोग करें और शुद्धि से पहले इसे अच्छी तरह से साफ करें।
  2. 100 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में एलबी मीडिया के 35 एमएल को इनोक्यूलेट करके ई कोलाई आरबी1 स्ट्रेन की रातोंरात संस्कृति तैयार करें। 260 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।

3 दिन:
नोट: कमरे के तापमान पर सभी चरणों को तब तक करें जब तक कि अन्यथा संकेत न दिया जाए।

  1. एक 5 एल बाँझ फ्लास्क में पौंड मीडिया के 2 एल जोड़ें, रात भर संस्कृति के 12 डिग्री के साथ टीका, और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 घंटे के लिए इनक्यूबेट जबकि २६० आरपीएम पर मिलाते हुए ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, 1 एल चकित फ्लास्क में संस्कृतियों के 4 x 500 एमएल में बैक्टीरियल कल्चरिंग करें।
  2. 3220 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को गोली मार। आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4 दिन:

  1. चरण 3.1.4 में तैयार कॉलम को बराबर करें। लाइसिस बफर के 30 एमएल के साथ।
  2. एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके लाइसिस बफर के 20 एमएल में गोली को फिर से रीसुस्ल करें।
  3. निम्नलिखित मापदंडों के साथ बर्फ पर 130 वाट की जांच सोनिकेटर (सामग्री की तालिकादेखें, जांच टिप व्यास: 6 मिमी) के साथ कोशिकाओं को Lyse करें: 11 x 20 एस पल्स पर; 20 एस पल्स बंद, 70% आयाम (प्रक्रिया विवरण के लिए चरण 2.16 देखें)।
  4. सोनीशन के तुरंत बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 21130 x ग्राम पर 20 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र द्वारा सेल मलबे को हटा दें। बर्फ पर lysate रखें।
  5. कॉलम में सुपरनेट लोड करें और इसे पास होने दें।
  6. लाइसिस और एल्यूशन बफ़र्स के निम्नलिखित मिश्रण के साथ कॉलम धोएं।
    1. 0 धोएं: लाइसिस बफर के 30 एमएल का उपयोग करें।
    2. वॉश 1: 5 एमएमएम इमिडाजोल के 30 एमएल (लाइसिस बफर के 29 एमएल, एल्यूशन बफर के 1 एमएल) का उपयोग करें।
    3. वॉश 2: 25 एमएम इमिडाजोल के 60 एमएल (लाइसिस बफर के 50 एमएल, एलयूशन बफर के 10 एमएल) का उपयोग करें।
    4. वॉश 3: 40 एमएल इमिडाजोल के 30 एमएल (लाइसिस बफर के 22 एमएल, एल्यूशन बफर के 8 एमएल) का उपयोग करें।
    5. वॉश 4: 60 एमएल इमिडाजोल के 30 एमएल (लाइसिस बफर के 18 एमएल, एलयूशन बफर के 12 एमएल) का उपयोग करें।
  7. एल्यूशन बफर के 7.5 एमएल के साथ राइबोसोम्स को एल्यूट करें। इल्यूटेड प्रोटीन को हर समय बर्फ पर रखें।
  8. राइबोसोम बफर के 45 एमएल में शुद्ध β-मर्केप्टोथेनॉल के 22 माइक्रोन जोड़ें।
    सावधानी: β-मर्केप्टोथेन जहरीला है। सुरक्षा सावधानियां बरतें और धूम हुड में काम करें।
  9. एल्यूएट को 15 एमएल सेंट्रलाइज फिल्टर में डालें और 1 एमएल पर ध्यान दें।
  10. केंद्रित नमूने में राइबोसोम बफर के 15 एमएल जोड़ें और फिर से 1 मिलील में ध्यान केंद्रित करें।
    नोट: पिछले चरण को दो बार दोहराएं।
  11. आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: विनिमय/एकाग्रता के एक दौर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 3220 x g पर लगभग 60 मिनट अपकेंद्रित्र होता है।
  12. बफर एक्सचेंज के दौरान, सेक्शन 1.4 में निर्दिष्ट कॉलम को बहाल करें।

5 दिन:

  1. राइबोसोम बफर में 1:100 पतला एक नमूना के 260 एनएम पर अवशोषण को मापने के द्वारा राइबोसोम एकाग्रता का निर्धारण करें। पतला समाधान के 10 का एक अवशोषण मूल्य 23 माइक्रोन अमिट समाधान से मेल खाता है जैसा कि पहले16वर्णित है ।
  2. 3.45 माइक्रोनएम की अंतिम स्टॉक एकाग्रता को लागू करें। एकाग्रता को समायोजित करने के लिए, राइबोसोम्स को राइबोसोम बफर के साथ पतला करें या 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 केडीए 0.5 एमएल सेंट्रलफ्यूगल फिल्टर में 14000 x g पर अपकेंद्रित्र द्वारा उन्हें आगे ध्यान केंद्रित करें।
    नोट: इष्टतम प्रणाली अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए, एक राइबोसोम एकाग्रता टिटरेशन (धारा 5.2, अनुपूरक तालिका 7)करें।
  3. धारा1.3.3में निर्दिष्ट एसडीएस-पेज (चित्रा 3 ए) का उपयोग करके राइबोसोम संरचना को सत्यापित करें। 7.5 माइक्रोन पानी के साथ नमूने के पतला 2.5 माइक्रोन, 2x Laemmli बफर के 10 माइक्रोन के साथ मिश्रण है, और फिर जेल पर नमूनों के 5 माइक्रोन और 2.5 माइक्रोन लोड।

  1. टैग-मुक्त राइबोसोम शुद्धि
    नोट: टैग-मुक्त राइबोसोम शुद्धिकरण एफपीएलसी प्रणाली(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके किया जाता है और 2 x 5 एमएल ब्यूटाइल कॉलम(सामग्रियों की तालिका)का उपयोग करके हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन क्रोमेटोग्राफी पर आधारित है। हालांकि राइबोसोम्स को किसी भी तनाव से शुद्ध किया जा सकता है, ई. कोलाई A19 (येल सीजीएससी मेंई. कोलाई जेनेटिक रिसोर्सेज) का उपयोग करना अपने RNase I हटाने22के कारण लाभप्रद है। या तो एक ठंडे कमरे या एक ठंडा कैबिनेट में 4 डिग्री सेल्सियस पर शुद्धि प्रदर्शन करते हैं। सामान्य उपज 10 माइक्रोन राइबोसोम के 0.5 एमएल के आसपास होती है, जो पांच सौ 10 माइक्रोन शुद्ध प्रतिक्रियाओं से मेल खाती है।

दिन 1:

  1. अनुपूरक तालिका 1में वर्णित बैक्टीरियल कल्चर मीडिया और मीडिया सप्लीमेंट तैयार करें ।
  2. आवश्यक सामग्रियों को तैयार करें और स्टरलाइज करें, जिनमें पिपेट टिप्स, 5 एल एर्लेनमेयर फ्लास्क और 100 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क शामिल हैं।
  3. अनुपूरक तालिका 2में वर्णित बफ़र्स और सप्लीमेंट तैयार करें। फ़िल्टर बोतल शीर्ष फिल्टर (0.45 माइक्रोन) का उपयोग करके सभी बफ़र्स को बंद कर दें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

दूसरा दिन:

  1. ई. कोलाई A19 तनाव की एक रात संस्कृति तैयार करने के लिए, एक १०० मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क में पौंड मीडिया के ३५ एमएल टीका । 260 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।

3 दिन:

  1. 5 एल बाँझ चकित फ्लास्क में पौंड मीडिया के 2 एल हस्तांतरण, रात भर संस्कृति के 30 मिलीएल के साथ टीका, और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 घंटे के लिए इनक्यूबेट जबकि २०० आरपीएम पर मिलाते हुए ।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 4000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को गोली मार। सस्पेंशन बफर के 25 एमएल में गोली को फिर से खर्च करें और आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4 दिन:

  1. चरण 3.2.13-3.2.19 के समानांतर चरण 3.2.8-3.2.12 करें।
  2. गल और एक 130 वाट जांच ध्वनिक का उपयोग कर कोशिकाओं lyse (सामग्री और जांच टिप व्यास की मेज देखें: 6 मिमी) निम्नलिखित मापदंडों के साथ बर्फ पर: 12 x 20 एस पल्स पर; 20 एस पल्स बंद, 70% आयाम (चरण 2.16 प्रक्रिया विवरण देखें)।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 20000 x g पर अपकेंद्रित्र द्वारा सेल मलबे को तुरंत हटा दें।
  4. सुपरनेट को एस्पिरेट करें और वॉल्यूम को मापें। अमोनियम सल्फेट की अंतिम एकाग्रता को 1.5 मीटर तक समायोजित करने और अच्छी तरह से मिलाने के लिए निलंबन बफर (उच्च नमक) की बराबर मात्रा जोड़ें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 20000 x g पर अपकेंद्री द्वारा तेज़ निकालें।
  6. एफपीएलसी शुद्धिकरण से पहले 0.45 माइक्रोन माइक्रोन पॉलीएथर्सल्फोन झिल्ली सिरिंज फिल्टर का उपयोग करके सुपरनेट को फ़िल्टर करें और 100 एमएल ग्लास बोतल में फिल्ट्रेट एकत्र करें। सुपरनिटेंट को हर समय 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  7. डबल ब्यूटिल कॉलम (2 x 5 एमएल) का उपयोग करके हाइड्रोफोबिक-इंटरैक्शन क्रोमेटोग्राफी शुद्धिकरण के लिए एफपीएलसी प्रणाली स्थापित करें। इस सेटअप के लिए, एक कॉलम वॉल्यूम (सीवी) 10 एमएल की मात्रा को संदर्भित करता है।
  8. तीन इनलेट्स की जरूरत होगी: दो बफर लाइनों के रूप में और एक नमूना लाइन के रूप में । प्यूरीफायर की डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स के कारण, बफर सी और बफर डी के लिए क्रमशः लाइन A1 और B1 चुनना सुविधाजनक है, और नमूना लाइन के रूप में लाइन A2। पंप वॉश (10 एमएल/मिनट) को छोड़कर 4 एमएल/मिनट की डिफॉल्ट फ्लो रेट लागू करें या जब तक कि अन्यथा इंगित न हो जाए ।
    नोट: के रूप में TCEP एक महंगा अभिकर्षक है, संतुलन कदम के बाद ही बफ़र्स सी और डी के लिए इसी राशि जोड़ें ।
  9. सिस्टम को साफ करने और पिछले शुद्धिकरण से संभावित संदूषण को दूर करने के लिए 20% ((v/v)) इथेनॉल में एक सिस्टम पंप वॉश करें। मैन्युअल रूप से 0.2 एमएल/मिनट की प्रवाह दर निर्धारित करें और कॉलम को माउंट करें। प्रवाह बंद करो।
  10. पानी के साथ एक सिस्टम पंप धोने को निष्पादित करें। कॉलम को 3 सीवी पानी से धोएं।
  11. संतुलन: बफर सी में इनलेट्स A1 और A2 और टीएमईपी के बिना बफर डी में इनलेट बी 1 रखें। एक पंप धोने पर अमल करें और बफर सी के 4 सीवी के साथ कॉलम को बराबर करें।
  12. बफ़र्स सी और डी में टीएमईपी जोड़ें।
  13. 4-5 मिलील्वन अंश एकत्र करने के लिए अंश कलेक्टर को 15 एमएल ट्यूब या स्पष्ट गोल अंश कलेक्टर ट्यूब तैयार करें।
  14. Loading: फ़िल्टर किए गए नमूने के साथ बोतल में इनलेट A2 रखें। कॉलम पर नमूना मात्रा का लगभग 90% लोड करें। 20 एमएल टीएमईईपी युक्त बफर सी के साथ नमूना पतला करें, और नमूने के 10 एमएल को कॉलम पर लोड करें। कम से कम दो बार कमजोर पड़ने के चरण को दोहराएं और जितना संभव हो कॉलम पर अधिक नमूना लोड करें। यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि मशीन में कोई हवा चूसा नहीं है।
  15. वाशिंग चरण 1: अनबाउंड घटकों को हटाने के लिए बफर सी के 3 सीवी के साथ धोएं।
  16. वाशिंग स्टेप 2: 80% बफर सी और 20% बफर डी के 5 सीवी के साथ धोएं।
  17. एल्यूशन: 5 सीवी की कुल एल्यूशन वॉल्यूम के साथ बफर सी का 50% और बफर डी का 50% लागू करके उत्पाद को स्पष्ट करें। इस अंश को कलेक्टर ट्यूबों में इकट्ठा करें।
  18. वाशिंग स्टेप 3: एल्यूट सभी दृढ़ता से 5 सीवी की कुल मात्रा के साथ 100% बफर डी का उपयोग करके संदूषकों से बातचीत करते हैं।
  19. 260 या 280 एनएम(चित्रा 4)पर नमूना अंश के अवशोषण स्पेक्ट्रम का विश्लेषण करें। पहली चोटी लोडिंग और पहले धोने के कदम के दौरान गैर-अवशोषित प्रोटीन को दिखाती है; दूसरी चोटी संदूषकों को दिखाती है जिन्हें दूसरे वाशिंग चरण के दौरान eluted किया गया है । तीसरी चोटी अंतिम उत्पाद पर नज़र रखता है, और अंतिम चोटी दृढ़ता से बातचीत करने वाले संदूषकों को दिखाती है। पूल सभी नमूना अंश आगे की प्रक्रिया के लिए तीसरे शिखर के अनुरूप। इल्यूटेड प्रोटीन को हर समय बर्फ पर रखें।
  20. चार पॉलीकार्बोनेट अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन ट्यूबों में कुशन बफर के 15 एमएल पर बरामद अंश को धीरे-धीरे ओवरले करें। सैंपल की अधिकतम 15 एमएल को कुशन बफर के 15 एमएल में डालें। नलकूप के वजन को संतुलित करना सुनिश्चित करें। 16 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 100000 x g पर अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन द्वारा राइबोसोम्स को गोली मारें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन ट्यूब में कोई दरारें मौजूद नहीं हैं।
  21. कॉलम को इस प्रकार साफ और रीसेट करें। 5 एमएल/मिन का प्रवाह दर अच्छी तरह से काम करता है । सभी इनलेट्स को पानी में रखें और पंप वॉश निष्पादित करें। कॉलम को 2 सीवी पानी से धो लें।
    1. इनलेट को 0.5 एम नाओएच समाधान में रखें, एक पंप वॉश करें, और बाद में नाओएच के 3 सीवी के साथ कॉलम धोएं।
    2. इनलेट को पानी में रखें, पंप वॉश करें, और फिर कॉलम को 2 सीवी पानी में धो लें।
    3. इनलेट को 0.1 एम एसिटिक एसिड समाधान में रखें, एक पंप वॉश करें, और बाद में एसीटिक एसिड समाधान के 3 सीवी के साथ कॉलम धोएं।
    4. पंप धोने और पानी के 2 सीवी के साथ कॉलम धोने।
    5. सभी इनलेट्स को 20% ((v/v)) इथेनॉल में रखें, एक पंप वॉश स्टेप निष्पादित करें, और कॉलम को 20% ((v/v)) इथेनॉल समाधान के 3 सीवी के साथ धोकर 20% ((v/v)) इथेनॉल में स्टोर करें ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि सिस्टम कभी भी शुष्क नहीं चलता है या हवा में बेकार नहीं होता है। बफर को सीधे इथेनॉल, या इथेनॉल पर बफर कभी न लगाएं। हमेशा बीच में पानी धोने का कदम जोड़ें, अन्यथा कॉलम को बंद करने का खतरा होता है। पर्याप्त नमूना संग्रह ट्यूब जोड़ना सुनिश्चित करें।

5 दिन:

  1. पारदर्शी गोली को परेशान किए बिना सुपरनेट और सावधानी से त्यागें, प्रत्येक गोली को बर्फ-ठंडे राइबोसोम बफर के 0.5 एमएल से धोएं। इस स्टेप को दो बार दोहराएं।
  2. सबसे कम संभव गति का उपयोग करके चुंबकीय उभारक पर चुंबकीय हलचल बार (3 एमएम व्यास, 10 m लंबाई) का उपयोग करके बर्फ पर राइबोसोम बफर के 100 माइक्रोन में प्रत्येक स्पष्ट छर्रों को फिर से ढंड करें। पुनर्नक्षित राइबोसोम्स को इकट्ठा करें और ट्यूबों को रिबोसोम बफर के अतिरिक्त 50 माइक्रोन के साथ धोएं।
    नोट: पारदर्शी गोली देखना मुश्किल है । इसलिए, ट्यूब के किनारों से गोली को सावधानी से धोएं।
  3. राइबोसोम बफर में 1:100 के अनुपात में पतला नमूने के 260 एनएम पर अवशोषण को मापने के द्वारा राइबोसोम एकाग्रता का निर्धारण करें। पतला समाधान के 10 का एक अवशोषण 23 माइक्रोन अमिट समाधान से मेल खाता है जैसा कि पहले16वर्णित है ।
  4. 10 माइक्रोन की अंतिम स्टॉक एकाग्रता को लागू करें। एकाग्रता को समायोजित करने के लिए, राइबोसोम्स को राइबोसोम बफर के साथ पतला करें या उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 केडीए सेंट्रलीफ्यूगल फिल्टर में 14000 x g पर अपकेंद्रित्र द्वारा आगे ध्यान केंद्रित करें।
    नोट: इष्टतम प्रणाली अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए, राइबोसोम टिटरेशन (धारा 5.2, अनुपूरक तालिका 7)करें।
  5. धारा1.3.3में निर्दिष्ट एसडीएस-पेज (चित्रा 3 ए) के साथ राइबोसोम संरचना को सत्यापित करें। 7.5 माइक्रोन पानी के साथ नमूने के 2.5 माइक्रोन को पतला करें, 2x लाम्मली बफर के 10 माइक्रोन के साथ मिलाएं, और फिर जेल में नमूनों के 5 माइक्रोन और 2.5 माइक्रोन लोड करें।

4. ऊर्जा समाधान

नोट: यहां पेश किए गए 2.5x ऊर्जा समाधान के लिए संरचना एक समाधान का एक उदाहरण है जो एक मानक TX-TL प्रतिक्रिया के लिए अच्छी तरह से काम करता है। समय को अनुकूलित करने के लिए, 2 दिन के दौरान ऊर्जा समाधान तैयार करें। अमीनो एसिड समाधान की तैयारी को विस्तार से समझाया गया है, इसके बाद अंतिम तैयारी प्रक्रिया है।

  1. अमीनो एसिड समाधान
    नोट: थोक में अमीनो एसिड समाधान तैयार करें। कम से कम 2000 μL की अंतिम मात्रा के लिए आवश्यक अमीनो एसिड स्टॉक समाधान की मात्रा तैयार करने से अन्यथा बहुत कम मात्रा में वजन त्रुटि कम हो जाएगी। अमीनो एसिड समाधान की समग्र एकाग्रता अमीनो एसिड और संबंधित स्टॉक समाधान सांद्रता की घुलनशीलता से सीमित है। मानक शुद्ध प्रणाली के लिए, 3.25 mM की अंतिम एकाग्रता के साथ एक समाधान तैयार करें। टेम्पलेट के रूप में अमीनो एसिडसॉल्यूशन कैलकुलेशन टेबल (सप्लीमेंट्री टेबल 3)का इस्तेमाल करें। पर्याप्त घुलनशीलता सुनिश्चित करने के लिए नमक के रूप में सिस्टीन का उपयोग करें। कोह-आधारित अमीनो एसिड तैयार करने के तरीकों का उपयोग करने से बचें। सभी अमीनो एसिड के लिए स्टॉक समाधान तैयार किए बिना अंतिम अमीनो एसिड समाधान में अमीनो एसिड की सटीक मात्रा को सीधे तौलना संभव है। हालांकि, यह अधिक चुनौतीपूर्ण और कम सटीक है ।
    1. टाइरोसिन को छोड़कर अनुपूरक तालिका 3में वर्णित प्रत्येक अमीनो एसिड के लिए स्टॉक समाधान तैयार करें।
      नोट: पानी में अमीनो एसिड की विभिन्न घुलनशीलताओं के कारण, स्टॉक समाधान की संबंधित सुझाई गई सांद्रता अलग-अलग होती है।
    2. न्यूनतम द्रव्यमान [मिलीग्राम] एक संदर्भ के रूप में लक्ष्य समग्र मात्रा के लिए पर्याप्त मात्रा में स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए आवश्यक अनुमानित न्यूनतम द्रव्यमान प्रदान करता है।
      नोट: न्यूनतम द्रव्यमान की गणना 10% के अधिशेष के साथ की जाती है।
    3. समाधानों की आसान तैयारी के लिए, अमीनो एसिड की सटीक मात्रा का वजन न करें, बल्कि इसके बजाय, हाथ में द्रव्यमान के लिए, वांछित एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पानी की मात्रा को समायोजित करें। अनुपूरक तालिका 3में स्प्रेडशीट का उपयोग करके वास्तविक द्रव्यमान (हल्के पीले कोशिकाओं) और वांछित एकाग्रता के आधार पर आवश्यक पानी (पानी [μL] को जोड़ने के लिए) की मात्रा की गणना करें।
    4. जब तक सभी तेज़ी भंग न हो जाएं तब तक वेर्टेक्सिंग द्वारा अमीनो एसिड स्टॉक समाधानों को सोलूबिलाइज करें। व्यक्तिगत अमीनो एसिड स्टॉक समाधान कई हफ्तों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
      नोट: कुछ अमीनो एसिड पानी में भंग करने के लिए मुश्किल कर रहे हैं; इस प्रक्रिया में कुछ समय लग सकता है।
    5. अमीनो एसिड समाधान के लिए सीधे ट्यूब में 3.25 m M की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए आवश्यक टायरोसिन की सटीक मात्रा का वजन करें।
      नोट: टायरोसिन पानी में घुलना बहुत मुश्किल है। स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करने के बजाय इसे सीधे जोड़ें।
    6. अमीनो एसिड स्टॉक समाधान और पानी की इसी मात्रा में जोड़ें जैसा कि अंतिम मात्रा में [μL] कॉलम (हल्के नीले रंग की कोशिकाओं) को जोड़ने और समाधान को अच्छी तरह से भंवर में जोड़ने के लिए है। आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर पूरा अमीनो एसिड समाधान स्टोर करें।
  2. ऊर्जा समाधान की तैयारी
    नोट: कुल मिलाकर, 2.5x ऊर्जा समाधान में प्रत्येक अमीनो एसिड का 0.75 m m, मैग्नीशियम एसीटेट का 29.5 m mमिला हुआ है, पोटेशियम ग्लूटामेट का 250 एमएम, एटीपी और जीटीपी का 5 एमएम, सीटीपी, यूटीपी और टीसीईपी का क्रमश 2.5 एमएम, ई कोलाई एमआरई 600 से 8.75 एमजी/टीआरएनए, 50 एमएम क्रिएटिन फॉस्फेट, 005 एमएम फॉइक्लिन एसिडिन, टीसीईपी शुक्राणुओं की 5 mm, और HEPES के 125 mM. पहली बार उपयोगकर्ता 200 माइक्रोल के छोटे बैचों में ऊर्जा समाधान तैयार करते हैं। बाद में उपयोग के लिए अनुपूरक तालिका 4 पर -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस के अनुसार तैयार किए गए व्यक्तिगत समाधानों को स्टोर करें।
    1. बर्फ पर अनुपूरक तालिका 5 में उल्लिखित सभी जलीय समाधानों को पिघलाएं।
    2. इस बीच, अनुपूरक तालिका 4में सूचीबद्ध शेष घटकों के लिए स्टॉक समाधान तैयार करें । तैयारी के बाद बर्फ पर सभी समाधान रखें।
      नोट: lyophilized tRNAs भंग करने के लिए सीधे शीशी के लिए RNase और DNase मुक्त पानी के ५०० μL जोड़ें । कोमल भंवर से अच्छी तरह मिलाएं; RNases शुरू करने से बचने के लिए पिपटिंग को सीमित करें।
    3. स्टॉक समाधान और पानी की गणना की गई मात्रा(अनुपूरक तालिका 5)जोड़ें और भंवर का उपयोग करके अच्छी तरह से मिलाएं। इसका घोल हर समय बर्फ पर रखें।
    4. समाधान के पीएच को तटस्थ रखने के लिए पीएच स्ट्रिप पर 1 माइक्रोन को पाइप करके समाधान के पीएच को मापें।
    5. बर्फ पर 50-100 माइक्रोन प्रति ट्यूब पर ऊर्जा समाधान को अलीकोट करें और आगे के उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। एलिकोटिंग करते समय, घटकों को उपजी से रोकने के लिए मुख्य स्टॉक को अक्सर भंवर।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, वाणिज्यिक ऊर्जा समाधानों के खिलाफ नए निर्मित ऊर्जा समाधान की गतिविधि परख का संचालन करें, उदाहरण के लिए पुरएक्सप्रेस में समाधान ए। यदि ऊर्जा समाधान के साथ प्रणाली का काफी कम प्रदर्शन देखा जाता है, तो आयन सांद्रता, विशेष रूप से मैग्नीशियम आयनों को टिटरेशन (5-20 mM) द्वारा अनुकूलित करना लाभप्रद हो सकता है।

5. वनपॉट शुद्ध प्रतिक्रिया

  1. डीएनए टेम्पलेट
    नोट: T7 प्रमोटर के डाउनस्ट्रीम को एन्कोड किया गया प्रोटीन या तो रैखिक या परिपत्र डीएनए से शुद्ध रूप से व्यक्त किया जा सकता है। एक्सटेंशन पीसीआर का उपयोग करके एक रैखिक डीएनए टेम्पलेट उत्पन्न करके, थकाऊ क्लोनिंग चरणों को छोड़ा जा सकता है। इस अध्ययन के लिए रैखिक टेम्पलेट्स पीसीआर द्वारा नीचे वर्णित, एक उच्च निष्ठा डीएनए बहुलक(सामग्री की तालिका) काउपयोग करके उत्पन्न किए गए थे। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्राइमर सीक्वेंस, पिघलने वाले तापमान और थर्मोसाइकिल सेटिंग्स को पूरक तालिका 6में निर्दिष्ट किया गया है। डीएनए टेम्पलेट तैयार करने के लिए दैनिक कार्यक्रम में शामिल नहीं है।
    1. पॉलीमरेज आपूर्तिकर्ता द्वारा अनुशंसित पीसीआर प्रतिक्रिया सेट करें।
      नोट: पूरक तालिका 6में उच्च निष्ठा वाले डीएनए पॉलीमरेज(सामग्री की तालिका) केलिए अनुकूलित पैरामीटर दिए गए हैं ।
    2. जीन-विशिष्ट प्राइमर (500 एनएम) (मापदंडों के लिए, अनुपूरक तालिका 6देखें) का उपयोग करके प्लाज्मिड या जीनोम से एक रैखिक टेम्पलेट के रूप में लक्ष्य जीन (उदाहरण के लिए, ईजीएफपी) को बढ़ाना।
    3. प्रवर्धन निम्नलिखित एक्सटेंशन पीसीआर चरणों के लिए एनीलिंग दृश्य प्रदान करने के लिए छोटे एक्सटेंशन उत्पन्न करता है।
    4. सही आकार और शुद्धता के लिए एक एगर उठे जेल पर एम्प्लिकॉन की जांच करें।
    5. बाद के विस्तार चरणों के लिए एक टेम्पलेट के रूप में प्रवर्धित डीएनए का उपयोग करें। कम से कम 50 माइक्रोन की प्रतिक्रिया सेट करें।
    6. एक्सटेंशन प्राइमर (2.5 एनएम) के साथ 10 पीसीआर प्रवर्धन चक्र चलाएं। प्रवर्धन चक्र को पूरा करने के बाद, तुरंत एक ही प्रतिक्रिया में अंतिम प्राइमर (500 एनएम) जोड़ें और विस्तारित पीसीआर उत्पाद को बढ़ाने के लिए 30 चक्र चलाएं। अनुपूरक तालिका 6में पिघलते तापमान और प्राइमर दृश्यों का पता लगाएं ।
    7. डीएनए शुद्धि किट का उपयोग कर डीएनए टुकड़ों को शुद्ध करें और एल्यूशन बफर युक्त EDTA के बजाय नाभिक मुक्त पानी में डीएनए को स्पष्ट करें।
    8. सही आकार और शुद्धता के लिए एक एगर उठे जेल पर रैखिक टेम्पलेट की जांच करें।
    9. यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके एनजी/माइक्रोन में डीएनए एकाग्रता को मापें।
  2. शुद्ध प्रतिक्रिया की स्थापना
    नोट: अंतिम प्रतिक्रिया संरचना 1x ऊर्जा समाधान, टैग-मुक्त राइबोसोम या उसके टैग राइबोसोम्स, वनपॉट शुद्ध प्रोटीन और डीएनए टेम्पलेट है। प्रतिक्रिया मात्रा अनुपात में 40% ऊर्जा समाधान, 30% प्रोटीन और राइबोसोम समाधान, और 30% डीएनए और पानी शामिल हैं। विशिष्ट प्रतिक्रिया की मात्रा 5 माइक्रोन और 25 माइक्रोन के बीच भिन्न होती है। प्लेट-रीडर पर लगातार फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करें। ग्रीन Lys का उपयोग करें in vitro अनुवाद लेबलिंग सिस्टम, जिसमें फ्लोरोसेंटी लेबल Lysine अवशेषों को नए संश्लेषित प्रोटीन में शामिल किया गया है, ताकि एसडीएस-पेज जेल पर गैर-फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति को सत्यापित किया जा सके। एक उदाहरण प्रतिक्रिया टेम्पलेट में दिया गया है अनुपूरक तालिका 7 शुद्ध सेल-मुक्त अभिव्यक्ति प्रतिक्रिया स्थापित करने में मदद करने के लिए। पीले रंग की कोशिकाएं उपयोगकर्ता-इनपुट मूल्यों को इंगित करती हैं, और नारंगी रंग की कोशिकाएं प्रतिक्रिया में वैकल्पिक रूप से जोड़े जाने वाले अतिरिक्त अभिकर् ती को इंगित करती हैं। सही आयन संतुलन सुनिश्चित करने के लिए घटकों के मात्रा अनुपात को सटीक रखें। उदाहरण के लिए, उच्च प्रोटीन एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, वनपॉट प्रोटीन समाधान एकाग्रता बढ़ाएं; हालांकि, प्रतिक्रिया में जोड़े गए प्रोटीन समाधान की मात्रा में वृद्धि न करें।
    1. स्प्रेडशीट में संबंधित पीली कोशिकाओं में डीएनए की एकाग्रता [एनजी/माइक्रोन] और लंबाई [आधार जोड़े] भरें। रिएक्शन के लिए डीएनए के 2-10 एनएम का इस्तेमाल करें।
    2. μL में वांछित कुल प्रतिक्रिया मात्रा में भरें।
    3. फ्रीजर से आवश्यक अभिकर्णों को निकालें और उन्हें बर्फ पर गल लें।
      नोट: कार्यक्षमता में कमी के बिना घटकों की पुनर्फ्रीजिंग संभव है। हालांकि, फ्रीज-गल चक्रों की संख्या को कम करें और जितना संभव हो उतना समय के नमूने बर्फ पर संग्रहीत किए जाते हैं।
    4. पिपेट पीसीआर ट्यूब के एक तरफ या 384-वेल प्लेट पर एक कुएं के एक कोने में पानी, डीएनए और ऊर्जा समाधान की गणना की गई है। किसी भी अतिरिक्त अभिकर्ण की आवश्यक राशि को एक ही तरफ जोड़ें। नमूना वाष्पीकरण और प्रयोगात्मक प्रारंभ समय पूर्वाग्रह से बचने के लिए प्रति प्रयोग नमूनों की संख्या को कम करें।
      नोट: ऊर्जा स्रोतों और कम पैदावार की समय से पहले खपत से बचने के लिए ऊर्जा घटक को शारीरिक रूप से प्रोटीन घटकों से अलग रखना महत्वपूर्ण है।
    5. पिपेट एक पीसीआर ट्यूब या 384-वेल प्लेट के विपरीत कोने के दूसरे पक्ष के लिए प्रोटीन और राइबोसोम समाधान की गणना की मात्रा।
      नोट: जब भी संभव हो मास्टर घोला जा सकता है का उपयोग करने के लिए पाइपिंग त्रुटियों के प्रभाव को कम करने के लिए । प्रारंभिक परीक्षण के बाद, राइबोसोम और प्रोटीन समाधान मिश्रित और एक समाधान के रूप में संग्रहीत किया जा सकता है।
    6. प्रतिक्रिया घटकों को मर्ज करने के लिए थोड़े समय (30 एस) के लिए स्पिन करें। प्लेट-रीडर प्रयोगों के दौरान वाष्पीकरण को रोकने के लिए, तरल मोम के 35 माइक्रोन जोड़ें और प्लेट को पारदर्शी सीलेंट (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ सील करें।
    7. न्यूनतम 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    8. प्लेट-रीडर पर रीडआउट के लिए, हर 2 मिनट में आवश्यक तरंगदैर्ध्य पर फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापें (प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3 Bमें दिखाए जाते हैं)।
    9. ग्रीन Lys लेबल नमूनों के लिए निम्नलिखित कदम प्रदर्शन करें।
    10. सेल-फ्री एक्सप्रेशन के बाद, ग्रीन Lys लेबलिंग किट की फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि को हटाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए RNase A के 0.16 μg/μL के साथ नमूना इनक्यूबेट करें।
      नोट: RNase A का उपयोग करें, क्योंकि अन्य प्रकार के RNases पृष्ठभूमि को पर्याप्त रूप से अच्छी तरह से नहीं निकालते हैं।
    11. धारा 1.3.3 में निर्दिष्ट एसडीएस-पेज चलाकर प्रोटीन अभिव्यक्ति की कल्पना करें। अन दागदार जेल को धीरे-धीरे डिएशनाइज्ड पानी में धोएं, और 488 एनएम की उत्तेजना तरंगदैर्ध्य का उपयोग करके फ्लोरोसेंट इमेजर पर इमेज करें।
    12. इसके बाद, पारंपरिक कूमासी धुंधला तरीकों का उपयोग करके जेल को दाग दें। उपयुक्त मापदंडों के लिए धारा 1.3.3 देखें।
      नोट: अनुशंसित राइबोसोम एकाग्रता के साथ प्रोटीन समाधान का एक टिटैशन करें और यदि आवश्यक हो, तो बाद में इष्टतम वनपॉट प्रोटीन एकाग्रता के साथ टिट्रेट राइबोसोम्स करें। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में वाणिज्यिक PURExpress ΤRibosome किट का प्रयोग करें। समाधान ए, फैक्टर मिक्स, और राइबोसोम समाधान क्रमशः तैयार ऊर्जा, वनपॉट प्रोटीन समाधान और शुद्ध राइबोसोम्स के अनुरूप हैं।

Representative Results

उपरोक्त प्रोटोकॉल किसी भी प्रयोगशाला में शुद्ध सेल-मुक्त टीएक्स-टीएल प्रणाली स्थापित करने की सुविधा प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। प्रोटोकॉल में शुद्ध प्रणाली के तीन अलग-अलग हिस्सों की तैयारी का विस्तृत विवरण शामिल है: वनपॉट प्रोटीन, राइबोसोम और ऊर्जा समाधान। एक विस्तृत दैनिक कार्यक्रम, जो वर्कफ़्लो का अनुकूलन करता है, तालिका 1में दिखाया गया है। वर्कफ़्लो को उनके टैग किए गए राइबोसोम्स के शुद्धिकरण के लिए अनुकूलित किया जाता है, और यदि टैग-मुक्त राइबोसोम शुद्धिकरण किया जाता है तो समय फ्रेम थोड़ा भिन्न हो सकता है। एक तैयारी न्यूनतम पांच सौ 10 माइक्रोल प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त मात्रा में शुद्ध प्रदान करती है। इसके अलावा, तैयार समाधान -80 डिग्री सेल्सियस पर एक वर्ष से अधिक समय तक स्थिर हैं और कई फ्रीज-गल चक्रों का सामना कर सकते हैं।

अंतिम प्रोटीन समाधान की कार्यक्षमता के लिए सभी उपभेदों के लिए पर्याप्त अतिव्यक्तता का स्तर महत्वपूर्ण है। चित्रा 1 वनपॉट प्रोटीन तैयार करने के लिए बाद में उपयोग किए जाने वाले सभी 36 व्यक्तिगत उपभेदों में सफल अतिव्यक्तता दिखाता है। अधिक व्यक्त प्रोटीन ' बैंड तीव्रता में भिन्नता सबसे शायद एसडीएस-पेज जेल पर मात्रा लोड करने में पूर्वाग्रह के कारण हुई । अपेक्षित प्रोटीन आकार तालिका 2में संक्षेप में प्रस्तुत किए जाते हैं। ग्लाइआरएस और पीएचईआरएस में विभिन्न आणविक भारों के दो उपइकाओं शामिल हैं; शेष 34 प्रोटीन में एक ही सबयूनिट शामिल है। इस प्रोटोकॉल की सादगी और समय-प्रभावशीलता की कुंजी कोक्यूरिंग और सह-शुद्धि चरण(चित्र 2)है। वनपॉट प्रोटीन समाधान अन्य सभी अभिव्यक्ति उपभेदों के संबंध में ईएफ-टू तनाव के अनुपात को बढ़ाकर तैयार किया गया था। अंतिम प्रोटीन की समग्र संरचना का विश्लेषण एसडीएस-पेज(चित्रा 3 ए)द्वारा किया गया था। जैल (लेन 2, 3) से, यह ध्यान देने योग्य है कि ईएफ-टू (43.3 केडीए) अन्य प्रोटीन की तुलना में उच्च एकाग्रता में मौजूद है, जैसा कि उम्मीद थी। जबकि जेल प्रोटीन अभिव्यक्ति अनुपात का एक अच्छा पहला संकेत प्रदान करता है, यह निर्धारित करना मुश्किल है कि प्रत्येक व्यक्ति प्रोटीन को किस स्तर पर व्यक्त किया गया था या नहीं। इसलिए, ऊपर दिखाए गए रूप में, प्रत्येक तनाव में अतिव्यक्तता की पुष्टि करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है।

ई कोलाई राइबोसोम एक जटिल आणविक मशीन है जो 50 से अधिक व्यक्तिगत प्रोटीन उपइकाओं23से बना है। टैग-फ्री राइबोसोम शुद्धिकरण के लिए 260 एनएम पर एक प्रतिनिधि अवशोषण स्पेक्ट्रम चित्र 4में दिखाया गया है; तीसरी चोटी सफल राइबोसोम एल्यूशन की विशेषता है। दोनों राइबोसोम शुद्धिकरण विधियों के लिए, एसडीएस-पेज जेल(चित्रा 3 ए)18 पर अपेक्षित रनिंग पैटर्न देखा गया था। हम दोनों शुद्धिकरण के लिए संदूषण का पालन किया था, हालांकि कम मात्रा में (<10%) विशेष रूप से, विभिन्न संदूषक टैग-फ्री (लेन 5, 6) और विधि में भिन्नता के कारण उनके टैग (लेन 11, 12) राइबोसोम्स में मौजूद थे। उपयोगकर्ता संदर्भ के लिए, संयुक्त प्रणालियों के लिए एसडीएस-पेज जैल भी शामिल हैं (लेन 8, 9, और 14, 15)।

अंत में, विभिन्न राइबोसोम वेरिएंट का उपयोग करके तैयार सिस्टम(चित्रा 3)के प्रदर्शन की तुलना की जाती है। इन विट्रो ईजीएफपी अभिव्यक्ति के समय पाठ्यक्रम बताते हैं कि दोनों शुद्ध प्रणालियां कार्यात्मक हैं और फ्लोरोसेंट ईजीएफपी का उत्पादन करती हैं। हालांकि, वनपॉट प्रोटीन समाधान ने अपने टैग किए गए राइबोसोम्स के साथ संयुक्त रूप से टिटरेशन द्वारा अनुकूलित राइबोसोम एकाग्रता का उपयोग करते हुए, गैर-टैग किए गए राइबोसोम संस्करण(चित्रा 3B)के अभिव्यक्ति स्तर का केवल एक तिहाई हिस्सा दिया। इसी तरह के परिणाम तब देखे गए जब विभिन्न आकारों के तीन प्रोटीन व्यक्त किए गए और इन विट्रो लेबलिंग सिस्टम(चित्रा 3 सी)में ग्रीन Lys tRNA का उपयोग करके लेबल किया गया। जैसा कि फ्लोरोसेंट जेल पर देखा गया है, दोनों प्रणालियों में पूर्ण लंबाई वाले उत्पादों को सफलतापूर्वक व्यक्त किया गया था; हालांकि, अभिव्यक्ति के स्तर का केवल आधा हिस्सा ही अपने टैग राइबोसोम सिस्टम के साथ हासिल किया गया था। फ्लोरेसेंस लेबलिंग के अलावा, सभी तीन प्रोटीन के लिए अपेक्षित बैंड एक कूमासी-दाग जेल(चित्रा 3 डी)पर अलग-अलग हैं। परिणाम बताते हैं कि पेश की गई अभिव्यक्ति प्रणाली, जिसे मानक उपकरणों के साथ प्रयोगशाला में एक सप्ताह के भीतर तैयार किया जा सकता है, का उपयोग रैखिक टेम्पलेट्स से टी 7 प्रमोटर के डाउनस्ट्रीम में प्रोटीन के इन विट्रो अभिव्यक्ति के लिए किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1:शुद्ध प्रणाली के सभी अभिव्यक्ति उपभेदों के लिए अतिव्यक्ति परीक्षण के लिए प्रतिनिधि परिणाम। शुद्ध प्रोटीन संख्या और आकार तालिका 2में संक्षेप में प्रस्तुत कर रहे हैं । प्रोटीन संख्या 21, 24, और 27 बेहतर दृश्य के लिए एक स्टार के साथ चिह्नित कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:वनपॉट प्रोटीन शुद्धिकरण। वनपॉट प्रोटीन समाधान के उत्पादन में शामिल सभी चरणों का योजनाबद्ध चित्रण और संबंधित तस्वीरें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:विभिन्न राइबोसोम वेरिएंट का उपयोग करके तैयार सिस्टम का प्रदर्शन। (ए)कूमासी ब्लू दाग एसडीएस-पेज जैल वनपॉट प्रोटीन सॉल्यूशन (लेन 2, 3), बिना प्रोटीन सॉल्यूशन (लेन 5, 6) और प्रोटीन सॉल्यूशन (लेन 8, 9) के बिना टैग किए गए राइबोसोम्स, प्रोटीन सॉल्यूशन के बिना उनकी टैग्ड राइबोसोम्स (लेन 11, 12) और प्रोटीन सॉल्यूशन (लेन 14, 15) के साथ । प्रति नमूना दो अलग-अलग सांद्रता भरी गई थी। (ख)ईजीएफपी अभिव्यक्ति की तुलना उनके टैग किए गए राइबोसोम्स और टैग-फ्री राइबोसोम्स की । इन विट्रो ईजीएफपी अभिव्यक्ति की फ्लोरेसेंस तीव्रता टैग-फ्री राइबोसोम्स (1.8 माइक्रोन, ब्लू) और उनके टैग किए गए राइबोसोम्स (0.62 माइक्रोन, रेड) का उपयोग करके शुद्ध प्रतिक्रिया के लिए समय के साथ निगरानी की जाती है। रैखिक टेम्पलेट और वनपॉट प्रोटीन समाधान की सांद्रता क्रमशः 4 एनएम और 2 मिलीग्राम/एमएल थी। पैनल(C)और(D)टैग-मुक्त (1.8 माइक्रोनएम,) के साथ वनपॉट में संश्लेषित प्रोटीन के एसडीएस-पेज जेल को दिखाते हैं। ब्लू, लेन 3, 4, 5) और उसके टैग राइबोसोम्स (०.६२ माइक्रोन, लाल, लेन 6, 7, 8) एक ग्रीनली इन विट्रो लेबलिंग किट(सी)के साथ लेबल और Coomassie नीले(डी)के साथ दाग, क्रमशः । काले तीर संश्लेषित प्रोटीन के अपेक्षित बैंड का संकेत देते हैं: ईजीएफपी (26.9 केडीए), एआरजीआरएस (64.7 केडीए), T7 आरएनएपी (98.9 केडीए)। रैखिक टेम्पलेट और वनपॉट प्रोटीन समाधान सांद्रता क्रमशः 4 एनएम और 1.6 मिलीग्राम/एमएल थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:260 एनएम पर अवशोषित स्पेक्ट्रा। टैग-मुक्त राइबोसोम्स के हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन शुद्धिकरण के दौरान 260 एनएम पर अवशोषित स्पेक्ट्रा के प्रतिनिधि परिणाम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 1: सभी वनपॉट शुद्ध समाधानों की तैयारी के लिए एक दैनिक समय-अनुकूलित शेड्यूल। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: शुद्ध प्रोटीन सूची कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक तालिका 1: रिएजेंट्स। तालिका में इस अध्ययन के दौरान उपयोग किए जाने वाले अभिकर्णों और घटकों की सांद्रता, मात्रा और अन्य विशिष्ट विवरण सूचीबद्ध किए गए हैं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक तालिका 2: बफ़र्स। स्प्रेडशीट प्रोटीन, टैग-मुक्त राइबोसोम, और उनके टैग राइबोसोम शुद्धिकरण के साथ-साथ उनकी तैयारी के लिए उपयोग किए जाने वाले स्टॉक समाधानों की सांद्रता के लिए सटीक बफर रचनाओं को सूचीबद्ध करती है। इसके अलावा, यह बफर वॉल्यूम के आधार पर घटकों की आवश्यक मात्रा की गणना करता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक तालिका 3: अमीनो एसिड गणना। स्प्रेडशीट में अमीनो एसिड और ऊर्जा समाधान के लिए आवश्यक उनके अनुशंसित स्टॉक समाधान सांद्रता को सूचीबद्ध किया गया है। यह वास्तविक तौला द्रव्यमान के आधार पर प्रत्येक अमीनो एसिड में जोड़े जाने वाले पानी की मात्रा की गणना करता है, और अंतिम अमीनो एसिड के मिश्रण में जोड़े जाने वाले अमीनो एसिड समाधान की मात्रा की गणना भी करता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक तालिका 4: ऊर्जा समाधान के लिए स्टॉक समाधान। तालिका ऊर्जा समाधान के लिए आवश्यक स्टॉक समाधानों की सांद्रता और मात्रा को सूचीबद्ध करती है और भंडारण की स्थिति सहित अधिक विवरण इंगित करती है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक तालिका 5: ऊर्जा समाधान। तालिका ऊर्जा समाधान घटकों और उनकी अनुशंसित सांद्रता को सूचीबद्ध करती है। इसके अलावा, यह उनके स्टॉक समाधान सांद्रता और ऊर्जा समाधान की मात्रा के आधार पर अंतिम समाधान में जोड़े जाने के लिए उनकी आवश्यक मात्रा की गणना करता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक तालिका 6: पीसीआर। तालिका में एक्सटेंशन पीसीआर के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर के दृश्यों और सांद्रता को सूचीबद्ध किया गया है और एक उच्च निष्ठा डीएनए बहुलक के लिए अनुकूलित तापमान और थर्मोसाइकिलर चरणों को पिघलने का संकेत देता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक तालिका 7: शुद्ध प्रतिक्रिया। स्प्रेडशीट शुद्ध प्रतिक्रिया का एक उदाहरण सेटअप दिखाता है। यह टैग-मुक्त राइबोसोम या उसके टैग राइबोसोम का उपयोग करके शुद्ध प्रतिक्रिया के लिए उपयोग की गई सांद्रता और घटकों की मात्रा को सूचीबद्ध करता है। इसके अलावा, यह प्रोटीन और राइबोसोम टाइटेशन के लिए मात्रा अनुपात की गणना करता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल मानक संरचना15के आधार पर एक बहुमुखी शुद्ध अभिव्यक्ति प्रणाली20 तैयार करने के लिए एक सरल, समय और लागत प्रभावी विधि का वर्णन करता है। आपूर्ति किए गए दैनिक कार्यक्रम(तालिका 1)के साथ प्रोटोकॉल का उपयोग करके, सभी घटकों को 1 सप्ताह में तैयार किया जा सकता है और पांच सौ 10 माइक्रोन शुद्ध प्रतिक्रियाओं तक के लिए पर्याप्त उपज राशि। चूंकि इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन उच्च प्रतिलिपि प्लाज्मिड से अधिक एक्सप्रेशन किए जाते हैं और ई कोलाईके लिए कम विषाक्तता होती है, इसलिए सभी आवश्यक प्रोटीन(चित्रा 1)के लिए अच्छी अभिव्यक्ति का स्तर देखा जाता है। यह उपभेदों के आसान समायोजन के लिए अनुमति देता है, और इसलिए20टीका उपभेदों के अनुपात को संशोधित करके, सहसंस्कृतियों में प्रोटीन संरचना भी। रिबोसोमल प्रोटीन के अलावा, ईएफ-टू की एकाग्रता अभिव्यक्ति पैदावार के लिए मौलिक महत्व के रूप में दिखाई दी6। इसके विपरीत, अन्य प्रोटीन घटकों की एकाग्रता में परिवर्तन का शुद्ध प्रणाली7,24की मजबूती पर अपेक्षाकृत कम प्रभाव पड़ा। इसलिए, अन्य सभी घटकों के संबंध में ईएफ-टू के टीका अनुपात को समायोजित करके, मानक शुद्ध संरचना के लिए एक तुलनीय संरचना प्राप्त की जा सकती है, और समान उपज20 के साथ एक शुद्ध प्रणाली प्राप्त की जा सकती है। प्रोटीन समाधान तैयार करने में, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि सभी उपभेदों अच्छी तरह से बढ़ते हैं और प्रेरण(चित्र 1)के बाद एन्कोडेड प्रोटीन को अधिक बढ़ाते हैं।

राइबोसोम कार्य शुद्ध प्रणाली24के समग्र प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण है । इस प्रोटोकॉल में राइबोसोम सॉल्यूशन तैयार करने के लिए दो अलग-अलग तरीकों का प्रदर्शन किया जाता है, यानी टैग-फ्री और उनकी टैग्ड राइबोसोम शुद्धि। टैग-मुक्त राइबोसोम शुद्धिकरण हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन क्रोमेटोग्राफी पर आधारित है जिसके बाद एक सुक्रोज कुशन के साथ अपकेंद्रित्र होता है, जिसके लिए एफपीएलसी शुद्धिकरण प्रणाली और अल्ट्रासेंट्रफ्यूज15तक पहुंच की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, उसके टैग राइबोसोम्स18 और गुरुत्वाकर्षण प्रवाह आत्मीयता गुणसूत्री शुद्धिकरण का उपयोग करने की विधि विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है और अधिकांश प्रयोगशालाओं में किया जा सकता है । इसलिए, उत्तरार्द्ध विधि सादगी और पहुंच जैसे फायदे लाती है। हालांकि, हमने टैग-फ्री वैरिएंट(चित्रा 3)की तुलना में वनपॉट प्योर में उनके टैग वाले राइबोसोम्स का उपयोग करते समय काफी कम संश्लेषण उपज देखी। आवेदन के प्रकार के आधार पर, यह कम उपज स्वीकार्य हो सकती है।

ऊर्जा समाधान कम आणविक वजन घटकों और ट्रान्स को विट्रो TX-TL प्रतिक्रियाओं में ईंधन के लिए आवश्यक प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल एक विशिष्ट ऊर्जा समाधान के लिए एक नुस्खा प्रदान करता है, जिसे उपयोगकर्ता की जरूरतों के आधार पर आसानी से समायोजित किया जा सकता है। ट्रान, एनटीपी और क्रिएटिन फॉस्फेट के साथ, शुद्ध प्रणाली8के समग्र प्रदर्शन के लिए एमजी2 + आयनों की बहुतायत और एकाग्रता महत्वपूर्ण रही है, क्योंकि वे प्रतिलेखन और अनुवाद के लिए महत्वपूर्ण कोफैक्टर हैं। कुछ मामलों में, आयनों का टिटरेशन, इसलिए, समग्र शुद्ध प्रदर्शन को बहुत बढ़ा सकता है। शुद्ध प्रदर्शन के लिए डीएनए अखंडता महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, प्रमोटर क्षेत्र, राइबोसोम बाध्यकारी साइट की पुष्टि करने और जीन को लक्षित करने और यह सुनिश्चित करने के लिए अनुक्रम कि पर्याप्त डीएनए एकाग्रता (<2 एनएम) एक शुद्ध प्रतिक्रिया स्थापित करते समय उत्पन्न होने वाले मुद्दों को उत्पन्न करने में मदद करेगा।

शुद्ध प्रणाली एक न्यूनतम TX-TL प्रणाली है, और विशिष्ट अनुप्रयोगों इस प्रकार अतिरिक्त समायोजन25की आवश्यकता हो सकती है । इनमें विभिन्न आरएनए पॉलीमरेसेस9,26,चैपरोन्स13और ईएफ-पी या अरफा8जैसे प्रोटीन कारकों को शामिल करना शामिल हो सकता है। हालांकि इन प्रोटीनों के लिए अभिव्यक्ति को कोकल्चर में शामिल किया जा सकता है, लेकिन उन्हें तैयार प्रणाली में अलग से जोड़ने से आवश्यक प्रोटीन के स्तर का बेहतर नियंत्रण मिल सकता है। इसके अलावा, वेसिकल्स का समावेश झिल्ली प्रोटीन10,11के उत्पादन के लिए आवश्यक है। वातावरण को कम करने के बजाय ऑक्सीकरण और एक डिसल्फाइड बॉन्ड आइसोमेराज़ उचित डिसल्फाइड बॉन्ड गठन की सुविधा प्रदान करता है, जो उदाहरण के लिए, स्रावित प्रोटीन12के लिए आवश्यक हैं।

यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि कोई भी अतिरिक्त घटक प्रतिक्रिया में हस्तक्षेप न करे। प्रतिक्रिया स्थापित करते समय या अन्य घटकों को जोड़ने पर ध्यान देने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारक नीचे सूचीबद्ध हैं। सुनिश्चित करें कि न तो असंगत बफ़र्स का उपयोग किया जाता है और न ही आयन सांद्रता परेशान कर रहे हैं। ग्लिसरोल, पोटेशियम, मैग्नीशियम, कैल्शियम आयनों, ओस्मोलाइट्स, पायरोफॉस्फेट, एंटीबायोटिक्स या ईडीटीए की उच्च सांद्रता वाले समाधानों से बचें। उदाहरण के लिए, डीएनए शुद्धिकरण के दौरान पानी के साथ एक एल्यूशन बफर की जगह फायदेमंद हो सकता है क्योंकि EDTA इस बफर में एक आम योजक है । एनटीपी या डीएनटीपी जैसे अतिरिक्त नकारात्मक आवेशित अणुओं के साथ समाधानों की आपूर्ति करने के लिए मैग्नीशियम एकाग्रता8को समायोजित करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि नकारात्मक आवेशित अणु चेलिंग एजेंटों के रूप में व्यवहार करते हैं और सकारात्मक रूप से आवेशित अणुओं को बांधते हैं। एक तटस्थ पीएच प्रतिक्रिया के लिए आदर्श है। तदनुसार, सभी घटकों को संबंधित पीएच पर बफर किया जाना चाहिए; यह एनटीपीएस जैसे अत्यधिक अम्लीय या बुनियादी अणुओं के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । अंत में, तापमान और मात्रा प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं । अच्छी उपज प्राप्त करने के लिए, किसी को 37 डिग्री सेल्सियस के आसपास तापमान लागू करना चाहिए, क्योंकि 34 डिग्री सेल्सियस से नीचे के तापमान से उपज27को काफी कम कर दिया जाएगा।

यह ध्यान रखना प्रासंगिक है कि OnePot शुद्ध तैयार करने से पहले, किसी को लक्ष्य आवेदन और संबंधित आवश्यकताओं, जैसे मात्रा, शुद्धता, संशोधन में आसानी, और घटकों को शामिल करने या चूक पर विचार करना चाहिए। कई अनुप्रयोगों के लिए, सिस्टम एक उत्कृष्ट विकल्प होगा, लेकिन दूसरों को पैदावार, समायोज्यता और अन्य कारकों की आवश्यकता हो सकती है, जो वनपॉट सिस्टम प्रदान नहीं कर सकता है। चाहे, शुरू किया गया प्रोटोकॉल किसी भी घर में बने सिस्टम को तैयार करने के लिए फायदेमंद होगा, क्योंकि इस तरह की तैयारी के लिए सभी महत्वपूर्ण कदम यहां संक्षेप में दिए जाते हैं।

OnePot प्रणाली के मुख्य फायदों में से एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध PURExpress प्रणाली के साथ इसकी अनुकूलता है, जो प्रत्येक PURExpress घटक को अपने OnePot समकक्ष के साथ क्रमिक रूप से बदलकर अलग से सभी घटकों की कार्यक्षमता और अखंडता का परीक्षण करने की संभावना प्रदान करता है। वनपॉट शुद्ध प्रणाली के फायदे, जैसे ट्यूनेबिलिटी और आसान, तेज और लागत प्रभावी तैयारी, सेल-फ्री टीएक्स-टीएल को दुनिया भर में अधिक प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ बना देगा और सेल-मुक्त सिंथेटिक जीव विज्ञान में इस शक्तिशाली मंच के कार्यान्वयन के विस्तार में योगदान देगा।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस काम को यूरोपियन यूनियन के क्षितिज 2020 रिसर्च एंड इनोवेशन प्रोग्राम ग्रांट 723106, स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन ग्रांट (182019) और ईपीएफएल के तहत यूरोपियन रिसर्च काउंसिल ने सपोर्ट किया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris/Glycine/SDS buffer Bio-Rad Laboratories 1610732
15 mL centrifuge tubes VWR International 525-0309
384-well Black Assay Plates Corning 3544
4-20% Mini-PROTEANRTM TGXTM Precast Protein Gels Bio-Rad Laboratories 4561096
50 mL centrifuge tubes VWR International 525-0304
96-Well Polypropylene DeepWell plate Nunc 260252
Acetic acid, 99.8 % Acros 222140010
Äkta purifier GE Healthcare purification of tag free ribosomes
AMICON ULTRA 0.5 mL - 3 KDa Merck Millipore UFC500324
AMICON ULTRA 15 mL - 3 KDa Merck Millipore UFC900324
Amino acids Sigma-Aldrich LAA21-1KT
Ammonium chloride Sigma-Aldrich 09718-250G
Ammonium sulfate Sigma-Aldrich A4418
Ampicillin Condalab 6801
BenchMark Fluorescent Protein Standard ThermoFisher LC5928
Breathe-Easy sealing membrane Diversified Biotech Z380059-1PAK
Centrifuge tubes polycarbonate Beckman 355631 purification of tag free ribosomes
Chill-out Liquid Wax Bio-Rad Laboratories CHO1411
Creatine phosphate Sigma-Aldrich 27920
DNA Clean & Concentrator-25 (Capped) Zymo ZYM-D4034-200TS
DTT SantaCruz Biotech sc-29089B
Econo-Pac Chromatography Columns Bio-Rad Laboratories 7321010
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma-Aldrich 03609-250G
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes VWR International / Eppendorf 525-0133
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap Falcon 352051
Flasks, baffled 1000 mL 4 baffles, borosilicate glass Scilabware 9141173
FluoroTect Green Lys in vitro Translation Labeling System Promega L5001 optional
Folinic acid Sigma-Aldrich PHR1541
Glycerol Sigma-Aldrich G7757-1L
HEPES Gibco 15630-056
HiTrap Butyl HP Column GE Healthcare 28411005 purification of tag free ribosomes
IMAC Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare 17-0921-07
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
InstantBlue Expedeon ISB1L-1L
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactoside) Alfa Aesar B21149.03
Laemmli buffer (2x), sample buffer Sigma-Aldrich S3401-1VL
Lysogeny broth (LB) media AppliChem A0954
Magnesium acetate Sigma-Aldrich M0631
Magnesium chloride Honeywell Fluka 63020-1L
Nickel Sulfate Alfa Aesar 15414469
NTP ThermoFisher R0481
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) ThermoFisher F530S
Potassium chloride Sigma-Aldrich P5405-1KG
Potassium glutamate Sigma-Aldrich 49601
PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit NEB E6800S
PURExpress Δ Ribosome Kit NEB E3313S
Quick Start Bradford 1x Dye Reagent Bio-Rad Laboratories 5000205
Rapid-Flow Sterile Single Use Vacuum Filter Units ThermoFisher 564-0020
RNaseA solution Promega A7973
SealPlate film Excel Scientific Z369659-100EA
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 6203
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin -hydrochlorid) Sigma-Aldrich 646547-10X1mL
Thickwall Polycarbonate Tube Beckman 355631
Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich T0699
Tris base ThermoFisher BP152-500
tRNA Roche 10109541001
Ultracentrifuge Optima L-80 Beckman purification of tag free ribosomes
Whatman GD/X syringe filters GE Whatman WHA68722504
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100mL

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References

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Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE Cell-Free System. J. Vis. Exp. (172), e62625, doi:10.3791/62625 (2021).

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