Beredning av pseudotypade H5-aviära influensavirus med kalciumfosfattransfektionsmetod och mätning av antikroppsneutraliserande aktivitet
Summary
Här beskrivs ett protokoll för pseudovirusförpackning och mätning av antikroppsneutraliserande aktivitet.
Abstract
Sedan 1996 har A/goose/Guangdong/1/96-härstamning högpatogen aviär influensa (HPAI) H5-virus orsakat influensautbrott hos fjäderfä och vilda fåglar. Ibland faller människor också offer för det, vilket resulterar i hög dödlighet. Ändå hindras HPAI-virusforskning ofta, med tanke på att den måste hanteras inom biosäkerhetsnivå 3-laboratorier. För att ta itu med detta problem antas pseudovirus som ett alternativ till vildtypvirus i vissa experiment av H5 HPAI-studier. Pseudovirus visar sig vara de perfekta verktygen för att studera neutraliserande antikroppar mot H5 HPAI-virus. Detta protokoll beskriver procedurer och kritiska steg för H5 HPAI-pseudoviruspreparat och pseudovirusneutralisationsanalyser. Den diskuterar också felsökning, begränsning och modifieringar av dessa analyser.
Introduction
Sedan 1996 har A/goose/Guangdong/1/96-härstamning högpatogen aviär influensa (HPAI) H5-virus orsakat kontinuerliga influensautbrott hos fjäderfä och vilda fåglar, vilket står för enorma socioekonomiska förluster i den globala fjäderfäindustrin. Ibland blir människor också smittade med det, inför en hög dödlighet 1,2. HPAI-virusforskning hindras dock ofta, eftersom den inte kan hanteras utanför biosäkerhetsnivå 3-laboratorier. För att ta itu med detta problem antas pseudovirus som ett alternativ till vildtypvirus i vissa experiment av H5 HPAI-studier. Pseudovirus är tillräckligt säkra för att träna i biosäkerhetsnivå 2-laboratorier.
H5 HPAI-pseudovirus tillhör chimära virus som består av surrogatviruskärnor, lipidhöljen med ytglykoproteiner från influensavirus och reportergener. Pseudoviruskärnor härrör vanligtvis från lentiviralt humant immunbristvirus (HIV), retrovirus såsom murint leukemivirus (MLV) och vesikulärt stomatitvirus (VSV)3. Specifikt används HIV-1-förpackningssystemet i stor utsträckning för att producera influensapseudovirus, där de primära generna som tillhandahålls är gag och pol. HIV-gag-genen uttrycker kärnproteiner. Pol-genen uttrycker integras och omvänt transkriptas, vilka båda är nödvändiga för uttrycket av rapportgenen i transducerade celler. Genom att efterlikna surrogatvirusets genom omfamnas reportergenen i pseudoviruskärnan i RNA-form. Reportergenen kommer att uttrycka proteinet i värdceller. Genuttrycksnivåerna för rapportgener kan användas för att mäta pseudovirusinfektionseffektivitet 3,4. Den primära rapportören är firefly-luciferas för att mäta de relativa luminiscensenheterna (RLU) eller den relativa luciferasaktiviteten (RLA) i transducerade celler. Andra reportrar som lacZ, Gaussia och Renilla luciferase används också, bara i mindre utsträckning5.
Pseudovirus är idealiska verktyg för att studera neutraliserande antikroppar mot H5 HAPI-virus. För att mäta den neutraliserande antikroppspotensen används pseudovirusneutralisering (PN) analyser6. Hemagglutinin (HA) och neuraminidas (NA) är glykoproteiner på ytan av influensa A-virus 7,8. HA består av en globulär huvuddomän för receptorbindning och en stamdomän för membranfusion. NA-proteinet har sialidasaktiviteten för att underlätta virusfrisättning 7,8. En PN-analys kan mäta neutraliserande antikroppar riktade mot HA-proteiner. Neutraliserande antikroppar riktade mot huvud- och stamregionen av HA kan också detekteras genom virusbindning och ingångsanalyser. Jämfört med vildtypvirus har pseudovirusneutraliseringsexperiment känsligare detektionsvärden, kan hanteras säkert i ett nivå 2-biosäkerhetslaboratorium och är i allmänhet lättare att använda i praktiken.
Detta protokoll presenterar i detalj procedurerna och kritiska steg för H5 HPAI-pseudoviruspreparat och PN-analyser. Den diskuterar också felsökning, begränsning och modifieringar av dessa analyser. I denna studie användes A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH)-stammen från H5N1 HPAI-virus som exempel. För att erhålla immunserum som används i analyser valde detta protokoll HA-proteinet från TH-stammen som immunogen för att immunisera möss.
Protocol
Representative Results
Discussion
HEK293FT celler används vanligtvis som förpackningsceller för att producera pseudovirus. Regelbunden mykoplasmadetektion är nödvändig under cellodlingen. Mykoplasmakontaminering kan drastiskt minska pseudovirusutbytet och ibland nära noll. Jämfört med andra föroreningar leder mykoplasmaföroreningar inte till pH-värdeförändringar eller grumlighet i cellodlingsmediet. Även en hög koncentration av mykoplasma är inte synlig med blotta ögon eller under ett mikroskop. Tre populära metoder för mykoplasmadete…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av forskningsbidragen från Innovation Capacity Building Project i Jiangsu-provinsen (BM2020019), Shenzhen Scientific and Technological Project (nr. JSGG20200225150702770), Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences (XDB29030103), Guangdong Scientific and Technological Project (nr 2020B1111340076) och Shenzhen Bay Laboratory Open Research Program (nr. SZBL202002271003).
Materials
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | — | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | — | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
References
- Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
- Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z. Combination of the immunization with the sequence close to the consensus sequence and two DNA prime plus one VLP boost generate H5 hemagglutinin specific broad neutralizing antibodies. Plos One. 12 (5), 0176854 (2017).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), 1963 (2018).
- Duvergé, A., Negroni, M. Pseudotyping lentiviral vectors: When the clothes make the virus. Viruses. 12 (11), 1311 (2020).
- Carnell, G. W., Ferrara, F., Grehan, K., Thompson, C. P., Temperton, N. J. Pseudotype-based neutralization assays for influenza: A systematic analysis. Frontiers in Immunology. 6 (161), (2015).
- Trombetta, C., Perini, D., Mather, S., Temperton, N., Montomoli, E. Overview of serological techniques for influenza vaccine evaluation: Past, present and future. Vaccines. 2 (4), 707-734 (2014).
- Wei, C. J., et al. Next-generation influenza vaccines: opportunities and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (4), 239-252 (2020).
- Krammer, F., et al. Influenza. Nature Reviews Disease Primers. 4 (3), (2018).
- Wei, C. J., et al. Induction of broadly neutralizing H1N1 influenza antibodies by vaccination. Science. 27 (329), 1060-1064 (2010).
- Chernov, V. M., Chernova, O. A., Sanchez-Vega, J. T., Kolpakov, A. I., Ilinskaya, O. N. Mycoplasma contamination of cell cultures vesicular traffic in bacteria and control over infectious agents. Acta Naturae. 6 (3), 41-51 (2014).
- Michael, R. G., Joseph, S. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Kumar, P., Nagarajan, A., Uchil, P. D. Transfection of mammalian cells with calcium phosphate-DNA coprecipitates. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), (2019).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Calcium phosphate transfection. Current Protocols in Molecular Biology. 9, (2003).
- Robert, E. K., Chen, C. A., Okayama, H., John, K. R. Transfection of DNA into eukaryotic cells. Current Protocols in Molecular Biology. 9, 11-19 (1996).
- Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures. Methods and Protocols. 3 (4), 69 (2020).
- . Luciferase assay system Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021)
- . Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021)
