初代および不死化ヒト角膜上皮細胞に対するUV放射および化学物質の毒性の決定
Summary
この記事では、初代および不死化細胞株でのUV放射および化学毒素の毒性を評価するために使用される手順について説明します。
Abstract
この記事では、初代(pHCEC)および不死化(iHCEC)ヒト角膜上皮細胞培養における紫外線(UV)放射線および眼毒素の毒性を測定する方法について説明します。細胞は、紫外線および毒性用量の塩化ベンザルコニウム(BAK)、過酸化水素(H 2 O2)、およびドデシル硫酸ナトリウム(SDS)に曝露された。代謝活性は、代謝アッセイを用いて測定した。炎症性サイトカインの放出は、マルチプレックスインターロイキン(IL)-1β、IL-6、IL-8、および腫瘍壊死因子-α(TNF-α)アッセイを用いて測定し、蛍光色素を用いて細胞の生存率を評価した。
細胞代謝活性およびサイトカイン放出に対するUVの有害な影響は、iHCECのUV曝露の5分およびpHCECの20分で発生した。iHCECおよびpHCECの代謝活性の同様のパーセント低下は、BAK、H2O2、またはSDSへの曝露後に発生し、 サイトカイン放出の最も重要な変化はIL-6およびIL-8で発生した。蛍光染色されたiHCECおよびpHCEC BAKばく露細胞の顕微鏡検査では、0.005%BAKばく露で細胞死が示されましたが、エチジウム染色の程度はpHCECよりもiHCECの方が大きかったです。顕微鏡を使用して毒性効果を評価する複数の方法、代謝活性の評価、およびサイトカイン産生を利用して、初代細胞株と不死化細胞株の両方でUV放射と化学毒素の毒性を決定できました。
Introduction
in vitro毒物学研究は、細胞に損傷を与える可能性のある化学物質やその他の薬剤の毒性作用を予測するために行われます。角膜に対する毒性の評価において、ヒト角膜上皮細胞(HCEC)は、これらの効果を評価するためのモデルにおいて使用されている1、2、3、4。これらのモデルは通常、細胞の代謝活性の変化、細胞増殖、および炎症性サイトカインの産生および放出などの他の細胞機能などの生理学的効果を評価します。これらの毒物学研究では、HCECに対する化学物質とUV放射の有害な影響を評価するために、さまざまなソースからの細胞が選択されています2,3。pHCEC株は、成人のドナー組織からこれらの細胞を提供する企業から入手可能です。初代細胞はディスパーゼで処理し、培養のために角膜を穏やかに掻き取ることができます5。次に、細胞はウイルスと汚染についてテストされ、10%ジメチルスルホキシドで凍結保存された状態で出荷されます。
初代細胞株の利点は、細胞がドナーの細胞と遺伝的に同一であることです。in vitro モデルは in vivo 組織を可能な限り模倣する必要があるため、これは理想的です。初代細胞株の欠点は、細胞分裂または継代の数が限られていることです6。利用可能な細胞数が限られているため、1回の初代培養で実施できる実験の数が制限され、実験のコストが増加します。
不死化細胞株は、細胞培養毒性モデルでも使用されています。しかし、in vivo組織から得られた初代細胞株とは異なり、不死化細胞株は遺伝的に改変されています。不死化細胞は、初代細胞のDNAにウイルスの遺伝子を組み込むことによって作成されます6,7,8。ウイルス遺伝子の取り込みに成功した細胞が不死化細胞株に選択されます。不死化の利点は、無期限の急速な増殖を可能にし、同じ細胞株を使用して複数の実験を実行するための無制限の数の細胞を提供することです。これにより、実験間の一貫性が確保され、コストが削減されます。
細胞増殖を制限する遺伝子の変化に加えて、重要な機能の遺伝子の発現の変化も起こり得る9。したがって、不死化細胞を使用することの欠点は、それらが様々な外部刺激に対するそれらの応答に関して、もはや元の インビボ 細胞を表していない可能性があることである10。比較には、初代および不死化ヒト角膜角膜細胞11、ならびに不死化HCECおよびウサギ角膜上皮初代細胞12に対する化学物質の毒性効果の観察が含まれていました。初代ヒト角化細胞と不死化角化細胞に対する毒素の影響の比較では、有意差は示されませんでした11。この記事で詳述されている方法を使用して、これらのアッセイの有効性を評価する pHCECおよびiHCECに対する紫外線および眼毒素の毒性が決定されます。
インビトロアッセイで一般的に使用される3つの眼毒素、BAK、H2O2、およびSDSが選択されました。BAKは点眼液13、14に一般的に使用されるカチオン性防腐剤であり、H2O2はコンタクトレンズ15の消毒に一般的に使用され、SDSは洗剤およびシャンプー14に見られるアニオン性界面活性剤である。眼の毒素と同様に、紫外線もHCECに重大な損傷を引き起こす可能性があります3。さらに、UVへの過度の曝露は、涙の症状、光過敏症、およびざらざら感を特徴とする光角膜炎として知られる眼の状態を引き起こす可能性があります16。
使用できる初代細胞培養物は無制限であり、開発されたさまざまな不死化細胞株があります。したがって、これらのタイプの細胞を組み込んだモデル間の類似点と相違点を決定するために、初代HCECを不死化HCEC株と比較するための調査が行われました。
この研究では、顕微鏡を使用して、UVおよび毒素に対する細胞の生理学的応答に関するpHCECとiHCECの違いの可能性を評価しました。2つの細胞株の細胞代謝活性と炎症性サイトカイン放出に対するUV放射と化学物質の影響も評価されました。2つの細胞株の違いを決定することの重要性は、1)細胞に対するUV放射の影響、2)細胞に対する毒素の影響、および3)将来の研究のために結果として生じる代謝、細胞生存率、および細胞サイトカイン放出の変化を評価するためのこれらの細胞株の最適な使用を理解することです。
Protocol
Representative Results
Discussion
2種類のHCECの使用における潜在的な違いが評価された。細胞を同じ濃度の細胞で同じ培地(HOEM)に入れ、短期間および長期間の紫外線と3つの眼毒素に曝露しました。UV放射と化学物質の線量は、比較できる中間応答を生成するのに十分な損傷を細胞に及ぼす生理学的効果に基づいて選択されました。UV放射で5分と20分、選択した線量のBAK(0.001%)、SDS(0.0025%)、およびH2O2(0.01%)の5分と15分のば…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らはこの研究のための資金を受け取らなかった。
Materials
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Staining buffer solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system | Carl Zeiss Inc., Germany | ||
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 – 700 nm (for assay 540/590) |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| glass bottom coverslips | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72. |
| Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
| Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media |
| Primary Corneal Epithelial Cells | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
| SpectraMax fluorescence multi-well plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | ||
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
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